绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

成孢延迟蛋白基因对枯草芽孢杆菌生物量和发酵酶活力的影响

探讨同种相噬对枯草芽孢杆菌内源酶发酵活力的影响.应用同源重组敲除的方法,构建了枯草芽孢杆菌168菌株的编码成孢延迟蛋白毒素前体的基因sdp C的knock-in突变株,比较了突变株和出发菌株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力.与出发菌株相比,突变株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力均显著提高,产酶高峰期酶活力提高23%.本研究结果显示,sdp基因突变不仅能够提高枯草芽孢杆菌的生物量,还能够提高其内源酶的发酵活力.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶产生菌诱变效应的研究

利用低能(30keV)氮离子注入中温中性α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌BF7658,研究对其产耐酸性α-淀粉酶的诱变效应.结果表明,BF7658菌株存活率曲线是典型的"马鞍型"剂量-效应曲线,在"马鞍型"区域对应注入剂量50×1014～100×1014 ions/cm2下具有较高的突变率.通过诱变筛选到一株最适作用pH为5.0,较出发菌株的最适作用pH偏低一个单位的突变株,编号TUST743.该突变株产酸性α-淀粉酶的酶活为343U/mL.该酶在pH4.5和4.0条件下的相对酶活为61%和38%,说明此突变株所产酸性α-淀粉酶对低pH有较好的耐受性.经连续传代实验,表明该菌株遗传性质稳定.     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichenifarmis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株．本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上，通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp，与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中，经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌，再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中，其阳性克隆在37℃1．0mmol/L IPTG诱导下，α-淀粉酶的基因得到了较好的表达．表达产物经SDS—PAGE鉴定，确定表达的蛋白大小为58000 Dal左右，与理论推导的分子量相一致；并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

产退浆酶优良菌株的选育及酶性质分析

为了获得纺织工业中所需求的高温退浆酶,从枯草堆、农田积肥、下水道等处土样中分离得到1株能向胞外分泌耐高温α-淀粉酶的菌株并对其产酶酶学性质进行研究。研究结果表明:该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),初步命名为Bacillus subtilisC1;菌株C1在基础培养基中(pH=7,温度45℃)培养24h左右达到生长稳定期,在68h时,酶活达到最高,为185.6U/mL;此α-淀粉酶最适作用pH值为6,最适温度为70℃;酶的耐热性能较好,在70℃处理1h,仍具有81%的酶活,适合高温退浆的需要。     

一株耐高温α-淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化

作者从四川成都及其周边地区的淀粉厂,米厂,面粉厂等样品采集地的土样和污水当中筛选到16株酶活较高的野生型α-淀粉酶生产菌,其中一株编号为C1的菌株酶活最高,液体发酵酶活达到20 U/mL.这株菌能在高温（50 ℃）下生长良好.在电子显微镜观察,有明显芽孢,生理生化常规鉴定为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）,进一步的16S rDNA分子鉴定确定该菌属于枯草芽孢杆菌,命名为B. subtilis C1. 并对B. subtilis C1的产酶条件进行优化.     

产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

为构建1株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化,以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌AS1.398的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得中性蛋白酶基因npr,与高拷贝质粒pWB980连接并转入蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB600中得到重组工程菌WB600/pWB980-npr.在初筛平板上工程菌蛋白酶活力明显高于工业生产菌AS1.398,工程菌发酵活力可达1,398.3,U/mL.通过对其发酵工艺进一步优化,在接种量5%、装液量100,mL/500,mL、摇床转速180,r/min、温度34,℃的条件下发酵48,h,发酵液的酶活力可达2,487.5,U/mL,比优化前提高了78%.     

酶制剂系列新产品

酶制剂系列产品“高转化率液体型糖化酶,耐高温α-淀粉酶,中温α-淀粉酶”,采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和高活率黑曲霉变异株菌经深层发酵培养、提取等工序精制而成。该产品质量高,属食品级。主要发酵指标分为:糖化酶30000u/ml 以上;中温α-淀粉酶500u/ml 以上;高温α-淀粉酶4500u/ml 以上。广泛适用于淀粉加工、制糖(葡萄糖、饴糖、糊精、果葡糖、低聚糖)、酒精、啤酒、味精、食品酿造、有机酸、制药、纺织印染、造纸和发酵等工业。     

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶产生茵诱变效应的研究

利用低能（30keV）氮离子注入中温中性α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌BF7658，研究对其产耐酸性α-淀粉酶的诱变效应结果表明，BF7658菌株存活率曲线是典型的“马鞍型”剂量-效应曲线，在“马鞍型”区域对应注入剂量50×10^14-100×10^14ions／cm^2下具有较高的突变率．通过诱变筛选到一株最适作用pH为5．0，较出发菌株的最适作用pH偏低一个单位的突变株，编号TUST743．该突变株产酸性α-淀粉酶的酶活为343U／mL．该酶在DH4．5和4．0条件下的相对酶活为61％和38％，说明此突变株所产酸性α-淀粉酶对低pH有较好的耐受性．经连续传代实验，表明该菌株遗传性质稳定、     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

枯草芽胞杆菌谷氨酰胺转氨酶在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达及诱导条件的优化

本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)(BTG)重组基因Sprodbtg,该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、pro D-BTG基因,并将该目的基因克隆入大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体p XMJ19中构建重组质粒p XMJ19-Sprodbtg.随后,重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中进行诱导表达,并对重组菌株的诱导条件进行优化.结果表明:重组菌株C.glutamicum ATCC13032/p XMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白pro D-BTG经活化后,BTG的活力达到(41.23±2.01)U/L;在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下,BTG的活力达到最高,为(55.62±2.34)U/L,较优化前提高了约34.90%,.     

枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

一株耐高温α-淀粉酶生产茵的分离鉴定及其产酶条件优化

作者从四川成都及其周边地区的淀粉厂,米厂,面粉厂等样品采集地的土样和污水当中筛选到16株酶活较高的野生型-α淀粉酶生产茵,其中一株编号为C-1的茵株酶活最高,液体发酵酶活达到20 U/mL.这株茵能在高温(50℃)下生长良好.在电子显微镜观察,有明显芽孢,生理生化常规鉴定为枯草芽孢杆茵(B.subtilis),进一步的16S rDNA分子鉴定确定该茵属于枯草芽孢杆菌,命名为B.subtilis C-1.并对B.subtilis C-1的产酶条件进行优化.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.