乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达

以酵母载体ＹＦＤ５９为基础,将乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因正向插入组成型启动子ＰＰＧＫ１及终止子ＴＰＧＫ１间,得到表达载体ＹＦＤ５９－ＬＳＳ１。并将该表达载体分别转化ＢＪ２１６８,ＤＢＹ７４６,ＪＲＹ１８８,ＢＪ３５０５ ４株不同的酿酒酵母株。再将ＹＦＤ５９－ＬＳＳＩ质粒上的表达单元克隆至高稳定载体ｐＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点,构建成３个带有不同拷贝数和不同插入方向表达单元的表达载体;ｐＨＣ１     

融合表面抗原SA—28基因在Pichia pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８插入质粒载体ｐＡＯ８１５的ＥｃｏＲ Ｉ位点中,将其置于Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母ＡＯＸ１启动子控制下,利用电转化技术,融合基因表达单元链同ＨＩＳ４基因被整合到受体菌ＳＭＤ１１６８基因组中。对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明：ＳＡ－２８基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;ＳＡ－２８融合基因的表达产物具有Ｓ和ＰｒｅＳ１的双重抗原性。用     

重组人Endostatin在甲醇酵母Pichia Pastoris中的分泌表达

为了获得高效表达分泌型重组人Endostatin菌株 ,利用基因工程技术 ,将目的基因连接到Pichia表达载体 pPIC9K中 ,将该重组质粒转入GS115菌株后筛选His阳性菌株 ,并用G4 18筛选高拷贝阳性克隆菌 .重组表达的Endostatin经SDS PAGE电泳 ,可在分子量 2 2kD处见到单一目标带 .经体外生物学活性检测 ,Pichia菌株表达的Endostatin能有效地抑制培养的ECV30 4细胞及P6 1细胞的生长 .     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA—28融合基因在酵母中的表达？…

采用酵母杂合启动子ＰＡＤＨＺ－ＣＵＰ１或ＰＡＤＨＺ－ＧＡＰＤＨ及终止子ＴＡＤＨ１,构建了一系列酵母表达载体。在这些表达载体中插入乙肝有面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８后将含乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒ＰＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点。     

杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达

在杂合启动子ＡＤＨ２－ＧＡＰＤＨ控制下于酿酒酵母中表达乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因的过程研究中,确定系统表达的有效阻遏条件为在１０．０ｇ／Ｌ的葡萄糖浓度下进行细胞的预培养,采用稀释操作和碳源饥饿培养等较彻底的支阻遏方式以克服葡萄糖酵解产物阻遏对表达的影响。实验还显示了溶解氧浓度对表达的影响和乙醇流加方式对表达期酵母生长与表达的调节作用。实验获得主培养４５ｈ后湿菌体浓度为１８６ｇ／Ｌ,细胞内ｐ     

人hIGF-1在Pichia pastoris酵母中的分泌表达及表达产物的鉴定

根据人IGF-l(Human Insulin-like Growth Factor-1，hIGF-1)的天然基因序列，在尽量保存原基因序列的基础上，将一些密码子换成Richia pastoris酵母的偏爱密码子，人工合成hIGF-1双链DNA.将此合成基因整合人X-33酵母的染色体上，用Zeocin+平板筛选得到重组菌株.以胞外分泌的方式表达了hIGF-1蛋白，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blot分析，得到该表达产物的相对分子质量约为7200.     

肝癌差异表达基因HCUTAL2在酵母Pichia pastoris中的表达

利用正常肝组织和肝癌组织的mRNA,通过逆转录方法,将Cy3和Cy5二种荧光分别标记到2种组织的cDNA上,制备成cDNA探针,并与包含4096条各种人类基因的DNA表达谱芯片进行杂交及扫描,重复11次实验,通过计算机数据处理判定基因是否在上述2种组织中存在表达差异,从而鉴定参与肿瘤发生的基因,其中1类差异表达基因为CUTA的高度同源基因,该基因可能参与重金属离子在体的代谢,对该基因拟编码的蛋白质进行酵母表达。     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控

采用酵母杂合启动子PADH2－CUP1或PADH2－GAPDH及终止子TADH1，构建了一系列酵母表达载体．在这些表达载体中插入乙肝病毒表面抗原S－preS1融合基因SA－28后，将合乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒PHC11的BamHI位点．然后将表达质粒分别转化酿酒酵母Y16，Y19．对SA－28基因表达的研究表明，在酵母菌胞内实现了SA－28基因的高表达，且表达受葡萄糖浓度调控．     

一个新的PMA诱导相关基因在Pichia Pastoris酵终系统中的表达

利用包含4096条各种人类基因的DNA芯片研究了代谢增强剂PMA（phorbol myristate acetate)激活的人单核巨噬细胞HTP－1的早期应答基因，根据已有的旧基因信息，实验结果基本反映了人单核巨噬细胞早期应答基因的表达谱，选取其中一条候选早期应答基因为后续研究对象，并进行蛋白质的酵母表达，为下游的基因功能研究奠定了一定的基础。     

Pichia pastoris表达系统提高表达量的几个关键点

Pichia pastoris是近年来迅速发展的一种真核生物表达宿主,有着广阔的应用前景．本文从提高Ppastoris表达重组蛋白产量的角度,就启动子、高拷贝重组子、密码子偏爱、宿主菌和高密度发酵等方面的优化进行了综述．     

转甲状腺素蛋白基因在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK TTR质粒上TTR基因切下,分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K.将重组的pPIC9K TTR用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子.转化子经摇瓶发酵,上清液用SDS PAGE检测,有明显的rTTR表达.经DEAE sepharoseF.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析,得到蛋白纯度大于95%的rTTR.经Westernblotting,分子质量和等电点测定等证明,毕赤氏酵母表达的rTTR与人血浆提取的TTR极为相似.     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达

构建3株表达凝乳酶的重组毕赤酵母,通过甲醇诱导收集BMMY液体培养基上清后,通过Arima K方法分别对其进行酶活测试并进行酶学性质分析.结果表明,GS115/pPIC9K-chy1菌株诱导7d后,其酶活达到1.905SU/mL重组凝乳酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH为6;在pH 4~7之间凝乳活性相对稳定;在50℃以下可以保持酶活,在55℃处理50min后,丧失60%的活性.     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒,并转化入E.coli TOP-10中,得到转纳豆激酶基因工程菌,提取重组质粒经单酶切,双酶切,PCR分析及序列测定,证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因,将重组质粒pPICZαA-NK线性化后,分别转化毕赤酵母GS115与KM71,在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母,经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性,SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘，然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中，用G418筛选高拷贝菌株，并进一步对其进行PCR鉴定，获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h，SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin，其大小约为11ku，并具有甜度。     

花鳗鲡重组促黄体生成素在毕赤酵母中的表达

 采用聚合酶链反应从花鳗鲡垂体cDNA中分别扩增出GTHα、LHβ基因,再利用搭桥技术,中间以linker将两个基因连接成单个基因LHβα。然后利用双酶切、连接,将LHβα基因连接到载体pPICZαA中,构建出促黄体生成素的酵母共表达载体pPICZαA-LHβα。再利用电转化法将其转入到酵母野生型菌株X-33中,在含不同浓度的zeocinYPDS平板上筛选高拷贝转化子,阳性克隆经φ=0.7%甲醇诱导表达,表达产物采用SDS-PAGE和western blot进行分析,得到所表达的产物相对分子质量约为45 000。