β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要成分之一,负责纤维素的最终降解,在畜牧生产、食品行业、能源和医疗卫生等领域都有重要应用.天然来源的β-葡萄糖苷酶表达水平低、分离纯化困难,阻碍了β-葡萄糖苷酶的进一步应用.利用蛋白质工程技术对β-葡萄糖苷酶进行体外改造,提高其糖苷水解或者低聚糖苷合成活性,是β-葡萄糖苷酶研究及应用的趋势.就β-葡萄糖苷酶体外分子改造的研究进展及成果进行综述,比较不同分子改造策略的特点,总结β-葡萄糖苷酶分子改造过程中的一般规律,展望β-葡萄糖苷酶分子改造的研究及发展方向,为微生物来源的β-葡萄糖苷酶的体外分子改造研究提供参考.     

南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征

采用硫酸铵分段盐析、透析、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖Sephadex G-100凝胶层析,从南日鲍内脏中分离纯化得到一种β-葡萄糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,所纯化的β-葡萄糖苷酶为单聚体,分子量约为90 kDa,N-端8个氨基酸残基序列为AGMLYPRV.β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH值为5.0,Mn2+、Cu2+、Ba2+和Zn2+对酶活力有显著的促进作用,而Al3+对酶有明显的抑制作用,SDS则使酶变性失活;pNPG与β-葡萄糖苷酶之间的亲和程度最高,纤维二糖和京尼平苷次之,水杨苷最差.     

β-葡萄糖苷酶研究进展

综述了β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）的分布、分类、理化性质、催化反应机制、活性测定方法、固定化及应用的国内外研究现状,并分别在其催化反应机制、活性测定方法、固定化和应用等4个方面提出了目前研究急待解决的问题,指出了解决目前存在问题的途径及研究趋势。     

壳聚糖固定化β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

采用交联吸附法将β-葡萄糖苷酶固定在壳聚糖上,方法简便易行.固定化酶的最适反应温度为50℃,相比于游离酶上升了10℃,且固定化酶提高了游离酶的热稳定性.固定化酶最适pH值为6.0,与游离酶相比上升了1.0,更耐碱.固定化酶对化学试剂稳定性增强,贮藏稳定性有显著提高.固定化酶优化了游离酶的部分酶学性质,具有一定应用价值.     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的制备及其性质研究

在活性炭、明胶等8种固定化载体筛选的基础上研究了以海藻酸钠为载体,戊二醛为交联剂固定化β-葡萄糖苷酶的条件,并对固定化酶的酶学性质及其在催化制备大豆异黄酮活性苷元染料木素中的应用进行了研究。β-葡萄糖苷酶在0.20%戊二醛溶液中交联2 h后再与20 g/L海藻酸钠混合,然后逐滴加到4 g/LCaCl2溶液中,固化1 h后过滤、洗涤得固定化β-葡萄糖苷酶,固定化酶的酶活回收率为83.67%。固定化酶的最适温度、热稳定性、pH值稳定性以及与底物的亲和力都有所提高,最适pH值基本不变。该固定化酶重复使用6次后其活力仍保持90.94%,染料木苷转化率达60.02%。     

固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质

以壳聚糖微球为载体构建了固定化β-葡萄糖苷酶,研究了固定化和游离β-葡萄糖苷酶的酶学性质.结果表明:固定化和游离β-葡萄糖苷酶的最适pH均为4.5;固定化β-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,比游离酶低5℃;固定化β-葡萄糖苷酶的pH稳定性和贮存稳定性明显高于游离酶,但热稳定性略低于游离酶;固定化和游离β-葡萄糖苷酶的表观米氏常数和米氏常数分别为0.52 mmol/L和2.4 mmol/L;固定化β-葡萄糖苷酶重复分批酶解10 g/L的纤维二糖,其操作半衰期为31 d左右.     

β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选

以黑曲霉为出发菌株,经紫外线-氯化锂诱变得13株长势良好的单菌落。通过水解水杨苷产还原糖方法测定这13株菌固态发酵产β-葡萄糖苷酶活力,结果表明,IK-7产酶活最高,可达118.95 U/mL,比原始菌株提高了将近6倍。     

两种不同方法固定化β-葡萄糖苷酶的研究

以自制的壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,考察了壳聚糖浓度对微球制备的影响,并采用吸附-交联法和交联-吸附法两种方法对β-葡萄糖苷酶固定化进行了研究.结果表明:(1)当壳聚糖:2％乙酸溶液=1∶20(w/w)时,最适合制球,成球粒径平均约为1.5mm.(2)采用交联-吸附法时固定率为43％,储存5天后剩余酶活力为67％,10天后剩余酶活力为52％,采用吸附-交联法时固定率为32％,储存5天后剩余酶活力为60％,10天后剩余酶活力为43％.因此,优化的固定化β-葡萄糖苷酶的方法为交联-吸附法.     

黑曲霉发酵粉中一种β-葡萄糖苷酶的分离纯化与表征

黑曲霉发酵酶粉通过硫酸铵分级沉淀、SephadexG-25脱盐、再通过两步DEAE-TOYOPEARL650M弱阴离子交换色谱,分离得到一个新的电泳纯的β-葡萄糖苷酶.该酶对水杨素的比活力为597.12IU mg,并对其专一,不能水解棉花和羧甲基纤维素钠;DTT处理前后分子量均为117.5kDa;最适pH和温度分别为4 5和70℃;在pH5.0、50℃下对水杨素钠的米氏常数Km为3.73mg mL,最大反应速率Vm为0.088mg葡萄糖 (mL·min).     

纤维素酶液中β-葡萄糖苷酶的分离纯化

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱、Source15Q阴离子交换柱、Source 15 S阳离子交换柱、HiTrap 16/60 Sephacryl S 200 HR凝胶过滤等技术,分离纯化3种来源里氏木霉、黑曲霉、里氏木霉与黑曲霉混合纤维素酶液中的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经SDS PAGE电泳鉴定均为电泳纯,测得黑氏木霉、黑曲霉单独培养β-葡萄糖苷酶相对分子质量分别为68、129 ku,而混合菌培养分离得到两种β-葡萄糖苷酶分子质量大小分别为66.2、134 ku。与单独培养的β-葡萄糖苷酶相似。3种来源的β-葡萄糖苷酶经多步分离纯化后的纯化倍数分别为37.25、40.21、30.12,酶活回收率分别为20.1 2%、23.21 %、28.56 %。     

分离浓缩的β-葡萄糖苷酶降低京尼平制备损失率的研究

为了减少京尼平在酶解制备过程中的损失,通过硫酸铵盐析及DEAESepharos52离子交换层析对黑曲霉发酵产生的β-葡萄糖苷酶进行分离浓缩,比活由1.09 U/mg提高到8.17 U/mg, 京尼平损失也从45.7%降低到7.7%左右,从而提高了京尼平的得率;另外,通过海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶,使酶的有效使用次数达到五次以上,提高了酶的使用效率,降低了成本.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选

采用牛津杯平板透明圈法对研究室保藏的17株黑曲霉菌株进行了β-葡萄糖苷酶产生菌初筛,得到5株透明圈相对明显的菌株,经固态发酵产酶复筛及相关纤维素酶活力的检测,选出一株β-葡萄糖苷酶酶活力高、且纤维素酶活力也较高的菌株niger-2,其β-葡萄糖苷酶酶活力为78.75 U/g、纤维素酶(CMC)活力为312.15 U/g...     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

水稻土壤宏基因组中的β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及酶活的研究

β-葡萄糖苷酶(Ec3.2.1.21)属于糖苷水解酶家族3,它能够水解非还原性末端的β-D葡萄糖苷键,释放出游离的葡萄糖及相应的配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素降解中的关键酶,对于可再生资源纤维素的利用具有十分重要的意义。本研究从水稻土壤中分离得到β-葡萄糖苷酶基因pds5,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,转化BL21大肠杆菌中,并诱导表达该基因。重组BL21大肠杆菌用IPTG诱导后,所提取的酶蛋白具有β-葡萄糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为83 kD。通过控制pH和温度的方法,测得该酶酶活最适pH为7.0,最适温度为37.5℃。     

蝾螺β-葡萄糖苷酶性质的初步研究

以海洋蝾螺(TurboPetholatusLinnaeus)内脏为原料,经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵沉淀初步抽提,再经DEAE cellulose(DE 32)、SephadexG 200等柱层析纯化,获得较纯的β 葡萄糖苷酶.本文对β 葡萄糖苷酶的基本性质进行初步研究,结果表明:β 葡萄糖苷酶催化底物pNP G水解的最适pH及最适温度分别为pH5.5和45℃.β 葡萄糖苷酶在pH为4.5～6.5之间稳定.温度30℃以上则逐渐失活.其反应Km为0.076mmol/L(37℃).活化能Ea为15.4kJ/mol.金属离子对酶的作用表明,Cu2 ,Hg2 ,Pb2 有强烈的抑制作用,Fe3 ,Cd2 ,Zn2 浓度小于1.0mmol/L时,抑制较弱,但在浓度大于1.0mmol/L时,抑制明显;Mn2 ,Ca2 在低浓度下对酶活力无明显影响,但在高浓度条件下有较强抑制作用,Mg2 略有激活效应.     

福寿螺β-葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究

以福寿螺内脏为材料,经本实验室开发的工业生产法制备粗酶粉,进一步采用葡聚糖凝胶（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００）和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０柱层析纯化,获得经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一纯的β－葡萄糖苷酶制剂．测定该酶的最适反应温度为４３℃,最适反应ｐＨ为５．１;在ｐＨ５．１,４５℃下,该酶催化水杨素水解的Ｋｍ值为３．４０ｍｍｏｌ／Ｌ,活化能为５０．６３ｋＪ／ｍｏｌ．研究几种效应物对酶活力的影响,结果表明：Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋对酶有激活作用,而Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、ＳＤＳ及脲对酶有不同程度的抑制作用,其中Ｃｕ２＋和Ｈｇ２＋对该酶的抑制作用最强,其抑制机理均表现为非竞争性抑制     

β-葡萄糖苷酶促进纤维素降解的应用

为了提高纤维素酶的作用效率，降低薯蓣皂苷元提取过程中纤维素带来的传质阻力，从而提高薯蓣皂苷元产率，在酶解的预处理过程中对糖液进行分离并添加β-葡萄糖苷酶分解体系中的纤维二糖．通过对不同预处理方式进行比较，考察了β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中的作用，分析了纤维素酶的作用机制和抑制机理，认为葡萄糖和纤维二糖对纤维素酶的抑制作用不可忽略利用实验结论对酶催化提取薯蓣皂苷元的工艺进行改进，使产率提高了29．3％．     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

用硫酸铵分级沉淀,凝胶过滤色谱,离子交换色谱等分离技术,对黑曲霉(Asper gillusniger)β-葡萄糖甙酶进行分离纯化,共得到4种酶组分(Ⅰ-la、Ⅰ-b、Ⅰ-lc、Ⅲb),经凝胶电泳鉴定均为单一带,Ⅰ-la、Ⅰ-lb、Ⅰ-lc、Ⅲb的最适pH分别为5.0、5.5、5.0、5.5,均在pH2.0～7.0之间稳定,最适温度分别为65、55、60、50℃;保温1h时的半失活温度t(1/2)分别为68、58、61、52℃,SDS-凝胶电泳法测得Ⅰ-la、Ⅰ-lb、Ⅰ-lc、Ⅲb的分子量分别为77000、67000、73000、43000,聚丙烯酰胺等电聚焦法测得四者的等电点分别为6.0、5.7、5.2和4.4.在所测定的化学试剂中,Ag~+、Hg~(2+)和Cu~(2+)对这4个酶组分均有较强的抑制作用,EDTA、SDS和脲对酶各组分也有明显的抑制作用。     

南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征

在对彩色岩石节理裂隙图像或灰度图像进行分割后,二值图像的骨架结果一般很难让人满意,因为图像中的各种噪声和线段的不连续性使测量困难并影响测量的精度. 根据曲线的细线化、 端点和节点的检测等设计并实现了一种基于二值图像形态学特性的曲线去噪、 断线连接及整体曲线分形拟合的方法,改善了以往检测出的节理裂隙曲线具有不连续性、 带有毛刺噪声及整体复杂度的判断问题,从而可以对每条裂隙曲线进行分形测量,不仅仅进行了单一曲线的分形描述,还进行了多曲线组合的分形描述,分形结果可作为评定整体节理裂隙的特征之一.     

碳源和氮源对黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影响

以黑曲霉(Aspergillus nigernl-1)为产酶菌种,研究了碳源和氮源对β-葡萄糖苷酶合成的影响。结果表明:麸皮为最好的碳源,适宜的使用量为4%;(NH4)2SO4、蛋白胨分别为较佳的无机氮源和有机氮源,由无机氮与有机氮组成的复合氮源更有利于β-葡萄糖苷酶分泌,其适宜比例为0.2%(NH4)2SO4和3.19%蛋白胨。通过碳源、氮源的优化,β-葡萄糖苷酶活力达到4.82 U/mL。