深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.