基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

巴氏醋杆菌核酸修复酶UvrA对大肠杆菌耐受性的影响

巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)具有较高的醋酸耐受性,常用于醋酸的发酵生产.微生物中核酸修复酶Uvr A与菌体对酸、热等不良环境的耐受性相关,本论文克隆巴氏醋杆菌AC2005中的核酸修复酶基因uvr A,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达,研究其对大肠杆菌醋酸、低p H、热和过氧化胁迫条件耐受性的影响.结果表明,分别在0.5%,醋酸、p H 3、53,℃、0.15%,H2O2这4种胁迫条件下处理40,min后,重组菌E.,coli JM109/p MV24-uvr A的存活率分别是对照菌E.,coli JM109/p MV24的11.2、4.7、19.2和7.5倍,说明来源于巴氏醋杆菌的核酸修复酶Uvr A能够提高大肠杆菌对醋酸、低p H、热与过氧化的耐受性,其原因可能是由于重组表达Uvr A提高了菌体在不同胁迫条件下对DNA的保护或修复能力.     

IrrE重组大肠杆菌的构建和性能分析

利用p ET-28a(+)质粒将来源于耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1的irr E基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行异源表达,在IPTG终浓度2,mmol/L、诱导温度37,℃、诱导培养6,h条件下进行了蛋白诱导.进一步考察Irr E异源表达对大肠杆菌生长性能和耐受能力的影响,结果表明:Irr E的表达能够提高大肠杆菌正常条件下的生长速率和最终生物量;同时,能够不同程度提高大肠杆菌在压力冲击下的存活能力,其中,高渗条件下存活能力的提高最为明显.而重组菌株在压力冲击下的生长速率和最终生物量均明显高于对照菌株.这说明Irr E在提高大肠杆菌的压力耐受性方面表现出良好的效果.     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

高选择性重组菌在含Hg^2＋环境中的生长富集Hg^2＋耦合及其连续处理Hg^2＋废水

研究了在低营养含汞环境中，高选择性汞富集基因工程菌E．coli JM109(表达MerT、MerP汞特异结合转运蛋白和金属硫蛋白MT，该菌简称为M1)的生长富集耦合行为．考察了汞离子浓度、离子强度、络合物、共存金属离子等环境因素对其生长富集Hg^2 耦合行为的影响；并且利用连续操作搅拌槽式生物反应器，实现了对有机废水配伍的含汞废水的连续化处理。     

重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究

为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。     

氧化还原敏感型元件调控大肠杆菌氧化胁迫耐受性

在大肠杆菌(Escherichia coli)中对自身和来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的转录因子SoxR的氧化胁迫抗性及元件通路进行了验证与改造。胁迫测试表明,在E.coli中过表达自身E-SoxR或异源表达Z-SoxR均不能提高菌株的胁迫耐受性。荧光定量分析表明,在E.coli中,联合下游基因过表达E-SoxR增强了菌株对抑制物的梯度响应,异源表达Z-SoxR反而降低了菌株对抑制物的梯度响应。在E.coli中,通过在SoxR下游连接抗性基因,分别获得了耐受H₂O₂和糠醛(furfural)胁迫的单基因菌株,进而构建双基因组合菌株,提升了大肠杆菌对双胁迫环境的耐受性,证明了氧化还原敏感型元件能够智能响应复杂抑制物条件下的胁迫。该研究为微生物利用木质纤维素水解液发酵生产奠定了基础。     

外加剂对提高固定化细胞制备L-苯丙氨酸能力的作用

在固定化细胞制备L-苯丙氨酸的研究体系中,以卡拉胶为固定化载体,所得的固定化细胞在使用过程中的催化稳定性较差,难以满足大规模生产的需要.故在卡拉胶包埋固定E.coli细胞过程中,对交联剂的处理方式和吸附剂的添加进行了研究.研究发现,复合交联剂对固定化细胞的处理能使固定化细胞的转化能力明显提高多乙烯多胺(质量分数0.25%)和已二胺(质量分数0.25%)对固定化细胞的组合处理,固定化细胞的转化能力提高了31.6%.在细胞包埋过程中添加质量分数4%的吸附剂E,固定化细胞的转化能力提高了近52%.     

活性黑染料脱色菌的分离鉴定及复合菌群培养研究

从活性污泥中分离得到6株活性黑脱色菌,从中筛选出脱色能力最强的菌株Y1,经菌落形态、生理生化特性及16S r RNA基因序列分析,鉴定该菌株属于希瓦氏菌属(Shewanella).通过两两复配、三三复配实验探究复合菌群的脱色效果,结果表明,混合培养后复合菌群对活性黑染料的脱色率较单一菌株培养时均有较明显的提高.部分复合菌群的脱色率在72 h后稳定在90%以上,其中复合菌株Y1+Y5的脱色率最高为95. 68%,并且其对印染工业废水也具有较强的脱色能力(脱色率为92. 69%).     

A/OMBR组合工艺处理酞菁染料KN-G废水

采用厌氧-好氧膜生物反应器组合(A/O MBR)工艺,处理含酞菁染料KN-G废水.研究A/O MBR对酞菁印染废水的降解能力,以及在添加微量元素Mn和不同的进水pH值条件下的降解特性.结果表明:A/O MBR工艺对酞菁染料KN-G印染废水的化学需氧量去除率可达到90%以上,脱色率为63%;添加微量元素Mn,A/O MBR系统对酞菁染料KN-G染料的脱色率下降.当进水pH值为3.0时,平均脱色效率最高达到80%,在酸性条件下酞菁染料的脱色率优于碱性条件.     

Overexpressions of Lambda Phage Lysis Genes and Biosynthetic Genes of Poly-β-hydroxybutyrate in Recombinant E.coli

A plasmid (pTU9) containing the lambda (λ) phage lysis genes S(-)RRz and the biosynthetic genes phbCAB of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) was constructed and transformed into E.coli JM109. Cultured in Luria-Bertani (LB) medium with 20 g/L glucose, E.coli JM109 (pTU9) could accumulate PHB in cells up to 40% (g PHB per g dry cells). A chelating agent EDTA was applied to induce a complete cell lysis and PHB granules were released. This method has a potential application in PHB separation.     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(I)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法,用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A.从该蛋白编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段.将所得片段与pMD l8-T载体连接,转化到JM l09大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂解法提取质粒,通过PCR和酶切分析,筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致.提取质粒,用BamHI和XhoI酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a( )和pGEX-6P-1中,转化JM l09受体菌,从JM l09受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,构建了人扭转蛋白A原核表达载体.IPTG诱导该工程菌,培养并离心收集.SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达.     

人和小鼠白细胞介素-5重组蛋白疫苗的提取

利用PCR技术从含有人和小鼠IL-5基因的质粒pORF9-hIL-5和pORF9-mIL-5质粒中扩增出人和小鼠IL-5基因序列,然后利用基因工程技术将人和小鼠IL-5基因序列分别插入原核表达质粒pQE30,获得人和小鼠IL-5重组表达质粒pQE-hIL-5和pQE-mIL-5.用酶切和DNA序列测定方法证实pQE-hIL-5和pQE-mIL-5正确后,转化感受态大肠杆菌JM109.用IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果表明:琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的人和小鼠IL-5基因序列相对分子质量大小和预期值一致,酶切pQE-hIL-5和pQE-mIL-5片段和预期值相符,DNA序列测定插入的人和小鼠IL-5 PCR产物基因序列和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白相对分子质量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达93%以上,抗组氨酸抗体可特异性识别hIL-5和mIL-5重组蛋白.     

大肠杆菌JM109对废水中铀(Ⅵ)的吸附实验研究

利用大肠杆菌JM109去除含铀废水,研究了在pH值、温度、吸附时间、铀离子的初始浓度、菌体浓度等,耐辐射奇球菌对铀的吸附效果.吸附试验结果表明耐辐射奇球菌有较高的吸附铀的能力,其中对低浓度的含铀废水处理潜力较大.当pH值为4.5时吸附效果最好,投加菌体浓度最佳为0.1 g/L,大约50 min左右达到吸附平衡,吸附量最高达到693.8 mg/g.吸附热力学研究其更符合Freundlich等温模型,吸附过程符合准二级动力学模型.     

Construction and Expression of GST and Carbon Skeleton of Amatoxins Fusion Gene

The primer, AT Forl, AT For2 and AT Back, are designed and synthesized for adding-PCR that is used to construct the fusion GST-AT gene. Depending on two-time adding-PCR amplification and the insertion of coding sequence of octapeptide carbon skeleton into the 3‘ temfinus of GST gene, the authors get the masculine recon, pGAT-1, confirmed by sequence detemfination and analysis, whose ORF is read-through. After IPTG induction and partial purification, SDS-PAGE electrophoresis is employed to detect the gene expression. The expressions of total bacterial proteins are about 21.3%, 22.5%, 19.32%, 21.73% in E. coli BL21, DH5α, JM109 and Top10 strains, respectively. Considering the quantity of induced total bacteria, the E. coli BL21 is the best one among the four recipient strains.This article supplies an academic foundation for producing biological active amatoxins.     

计算机辅助设计改善重组人神经珠蛋白(hNGB)在E.coli中的表达

人神经珠蛋白(hNGB)是新发现的人类脑特异的携氧蛋白.为对其结构和功能进行深入的研究,首先,利用分子生物学实验辅助设计软件BioSun1.0分析了hNGB基因与pBV221载体连接处的二级结构和hNGB基因的局部密码子偏爱性,并依据原核系统外源基因高效表达数学模型对hNGB基因进行了高效表达设计;其次,构建了hNGB基因编码区原核表达载体pBV221-hNGB;最后通过转化大肠杆菌JM109,热激诱导,获得了hNGB基因的高效表达.表达水平约为12%,从而为进一步研究hNGB基因的结构和功能奠定了重要基础.     

利用基因工程菌去除电解废水中的汞离子

利用构建的基因工程菌生物富集真实电解废水中的汞离子。电解废水中除含有2.58mg/L的汞离子外，还含有十种以上的其它成分，且pH值为9．6。实验表明，与重组菌对只含汞离子的实验室模拟废水的处理结果比较，电解废水中其它组份的存在意外地增大了重组菌富集汞离子的作用速率，但同时却使细菌的最大汞富集是降低了30％。废水pH的变化对重组菌的汞富集行为影响很小，说明该基因工程菌能在很宽的pH范围内有效地富集汞。实验还考察了EDTA及离子强度对富集行为的影响。     

甘薯羽状斑驳病毒中国分离株外壳蛋白基因的克隆和序列分析

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,以我们从国内甘薯品种徐薯-18上分离到的SPFMV的RNA为模板,经过反转录合成cDNA第一条链,经PCR扩增、限制性酶切后克隆于pUC19的Hind 和SacI位点,转化大肠杆菌JM109,经限制性酶切分析、PCR鉴定以及序列分析证实获得了SPFMV中国分离株外壳蛋白基因的全长克隆.     

产丁醇重组大肠杆菌的构建及初步发酵

将丙酮丁醇梭菌ATCC 824丁醇合成途径中分别编码硫解酶(THL)、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(HBD)、巴豆酸酶(CRT)、丁酰-CoA脱氢酶(BCD)和醛/醇脱氢酶(BDH)的关键基因thil、hbd、crt、bcd-etfB-etfA、adhE在大肠杆菌中进行重组表达,构建出3株产丁醇的重组大肠杆菌JM109-99d、DL1346 99d和AFP111-99d。选取摇瓶发酵产丁醇最高(0.52 g/L)的重组大肠杆菌DL1346-99d进行上罐发酵,丁醇产量可达1.07g/L。