调节细胞自噬对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的影响

以鱼藤酮处理的PC12细胞为帕金森病体外模型,分别使用雷帕霉素作为自噬途径的促进剂,巴佛洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤作为抑制剂,检测调节细胞自噬对细胞凋亡的影响,发现巴佛洛霉素A1极大提高了细胞凋亡率,3-甲基腺嘌呤则可以减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡,而雷帕霉素虽然促进受损细胞凋亡,但降低了受损细胞早期的死亡率.构建pEGFP-LC3 稳定转染的PC12细胞,流式细胞检测结果显示,抑制或促进细胞自噬,细胞内自噬相关蛋白LC3均有明显增加.     

益智仁中的原儿茶酸对鱼藤酮损伤PC12细胞的保护作用

建立鱼藤酮(rotenone)诱导的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma,PC12)损伤的类帕金森病细胞模型,探讨益智仁中的原儿茶酸(PCA)对该类帕金森病细胞模型的保护作用及其可能作用机制.采用四唑盐(MTT)方法检测细胞活力,并且采用乳酸脱氢酶(LDH)方法作为细胞活力的进一步验证;对于细胞形态变化采用Hoechst 33258染色法进行观察;采用细胞内常见的抗氧化酶试剂盒(超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px))分别检测细胞内各抗氧化酶含量的变化;对于细胞内活性氧(ROS)水平的变化采用2',7'-二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)进行检测;用Caspase-3/CPP32 Colorimetric试剂盒检测细胞内Caspase-3的活性.将0.5μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h后,诱导其产生典型间接氧化应激过程并产生凋亡特征,益智仁中的1 m M原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤有明显的抗凋亡保护作用,其可能机制是增强细胞内源性抗氧化酶的活力,抑制活性氧的产生,阻止Caspase-3的激活途径,从而达到减少或抑制细胞凋亡的目的.     

鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞对过氧化氢损伤易感性增高与硫氧还蛋白下调有关

帕金森病(PD)的发病机制与线粒体呼吸链复合物I(complex I)活性降低以及氧化应激损伤密切相关.使用complex I特异性抑制物鱼藤酮,损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后,给予H2O2造成氧化应激损伤,以研究细胞抗氧化损伤能力变化的可能机制.结果表明,鱼藤酮处理后,细胞对H2O2所致氧化损伤的易感性增高,且细胞形态及细胞存活率的改变与鱼藤酮浓度呈量效关系.与此同时,细胞内抗氧化蛋白之一,硫氧还蛋白(thioredoxin)水平在细胞损伤时明显下降.以上结果表明,线粒体complex I抑制对细胞氧化应激易感性的影响可能与胞内硫氧还蛋白水平降低有关,提示硫氧还蛋白在诊断神经元损伤和神经保护中有一定的运用前景.     

运用乙醇渗漉法优化三叶鱼藤中鱼藤酮提取工艺——基于响应面法

三叶鱼藤伴生红树林植物，严重威胁红树林生态系统.为了变废为宝，挖掘三叶鱼藤中活性物质鱼藤酮，采用渗漉法浸提，选择乙醇浓度和提取时间2个因素，进行响应面法优化提取鱼藤酮，利用液相色谱检验鱼藤酮含量.结果表明，当乙醇浓度为84%，提取时间为4.1 d时，鱼藤酮含量为1.97%，与预测值的相对误差仅为2.48%.因此鱼藤酮的优化模型可行.     

野木瓜三萜皂苷类化合物抗炎活性研究

为了研究野木瓜藤茎中三萜皂苷类化合物的抗炎活性,以LPS诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症反应模型,采用Griess法检测一氧化氮(NO)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β含量;Hochest33258荧光染色观察细胞凋亡形态。结果表明:从野木瓜藤茎的正丁醇提取物中得到两个皂苷类化合物均可显著抑制NO释放;其中化合物1可显著抑制IL-1β产生,且能观察到明显的细胞凋亡现象,两种皂苷化合物均具有一定的抗炎活性.     

黄连素调节eNOS/NO保护软脂酸诱导的HUVECs损伤作用机制研究

目的研究黄连素对软脂酸诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制.方法采用500μmol/L软脂酸培养HUVECs 24 h,建立内皮细胞损伤模型,MTT法观察黄连素对细胞存活率的影响;检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)含量;RT-PCR法检测内皮型一氧化氮合酶(e NOS)mRNA水平;Western blot方法检测e NOS和磷酸化e NOS蛋白的表达.结果与对照组比较,软脂酸组细胞存活率降低(P0.05),培养液中NO含量下降(P0.05),细胞内e NOS mRNA水平、e NOS及磷酸化e NOS蛋白表达水平均显著下降(P0.01,P0.05).与软脂酸组比较,黄连素组细胞存活率增加,培养液中NO含量明显提高(P0.05),细胞内e NOS mRNA水平和磷酸化蛋白表达水平均显著提高(P0.01,P0.05).结论黄连素对软脂酸引起的血管内皮细胞损伤有显著的保护作用,并可能与上调e NOS、促进NO生成有关.     

鱼藤根抽提物中鱼藤酮的高效液相色谱分析

建立了鱼藤根抽提物中鱼藤酮的高效液相色谱分析方法,试样用丙酮溶解,鱼藤酮含量用配备有Hypersil ODS(5m,250mm×4mm)色谱柱和紫外检测器的反相高效液相色谱法测定．确定的最佳液相色谱检测条件为：检测波长290nm；流动相,体积比为60：40的乙腈/水混合液；流速1mL/min；进样量10μL．此方法对鱼藤酮的测定准确度和精密度均很好,适合于鱼藤根抽提物中鱼藤酮的含量分析．     

茶叶糖蛋白对RAW264.7细胞分泌作用的影响

本文研究利用小鼠巨噬细胞建立体外实验模型,对茶叶糖蛋白(TGP)的免疫活性进行研究。采用倒置显微镜观察细胞形态变化。Griess法和ELISA法检测不同剂量茶叶糖蛋白对RAW264.7细胞一氧化氮(NO)和细胞因子TNF-α、IL-1β分泌量的影响。结果表明:50μg/mL茶叶糖蛋白可显著促进细胞分泌一氧化氮和细胞因子TNF-α、IL-1β(p<0.01),说明茶叶糖蛋白可通过促进细胞分泌一氧化氮和细胞因子,起到活化RAW264.7细胞和调节机体免疫的功效。     

重组诱导型一氧化氮合酶基因转染血管平滑肌细胞及对其增殖的影响

探讨重组诱导型一氧化氮合酶基因转染血管平滑肌细胞及产生的一氧化氮对血管平滑肌细胞增殖的影响。将诱导型一氧化氮合酶基因通过真核表达载体转入血管平滑肌细胞中 ,用Griess法测定转染细胞生成的一氧化氮的量。观察转染后平滑肌细胞生长状态情况 ,用流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果正常细胞组NO的含量为78.4 4± 1 5 .38,而iNOS转染组NO含量为 2 36 .5 7± 31 .83,两组相比有非常显著差异 (P =0 .0 0 0 ,n =6 ) ,血管平滑肌细胞转染后生成一氧化氮。转染后的平滑肌细胞生长明显受到抑制 ,主要抑制平滑肌细胞周期G1 S期的过渡 ,使细胞停留在G1期。说明血管平滑肌细胞可以成功转染iNOS基因 ,生成的一氧化氮可明显抑制平滑肌细胞的增殖 ,为从血管非内皮成分进行iNOS基因转染提供了实验研究的依据     

高糖和外源性硝化试剂导致人脐静脉内皮细胞蛋白质硝化的研究

采用细胞生物学及化学方法,检测了高浓度的糖和外源性硝化试剂作用于人脐静脉内皮细胞(ECV304)后所导致的细胞蛋白氧化损伤及硝化损伤.结果发现:高浓度的糖(30和40 mmol/L)可以导致细胞发生氧化损伤,主要包括降低细胞存活率、降低胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量、增加胞内一氧化氮(NO)代谢产物亚硝酸盐和硝酸盐的含量;在细胞蛋白内也检测到蛋白质硝化的产物.研究发现:蛋白质硝化可以进一步加强细胞损伤的程度,而高浓度的糖和外源性硝化试剂导致的细胞蛋白硝化有所不同,其原因可能是在糖尿病血管并发症中蛋白质是有选择地发生硝化反应的.     

氯化钴对人eNOS基因启动子转录活性的影响

目的:建立氯化钴诱导的人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)缺氧模型,研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因的启动子活性变化.方法:用含不同浓度氯化钴的培养基培养细胞,检测细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量;将已构建的pGL2-eNOS-p质粒转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测在不同浓度氯化钴和不同作用时间下的eNOS启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的LDH含量随氯化钴作用浓度增加而提高;氯化钴刺激后转染细胞的eNOS启动子活性呈现随氯化钴剂量增加而升高的趋势,随作用时间的延长而上升的趋势.结论:成功建立氯化钴诱导HUVEC-12细胞缺氧的体外模型.     

原花青素对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

帕金森症(Parkinsons disease,PD)是一种老年人群常见的中枢神经系统变性病,因发病率明显上升,其病因与防治策略亟待阐明.文中以多巴胺能神经元模型细胞PC12为材料,以致PD毒性物质鱼藤酮(Rotenone,Rot)处理细胞,检测原花青素(Grape seeds procyanidins,GSP)对Rot引起细胞毒性的防护作用,并探讨其机理.MTT法显示,GSP可减弱Rot对细胞生长的抑制作用,其效果具有浓度和时间依赖性;倒置显微镜观察吉姆萨染色和荧光染料Hoechst 33342染色后显示,Rot处理细胞由平铺多角形变为皱缩,突起回缩,细胞核染色质凝集,部分细胞核碎裂,呈现一定凋亡特征;GSP预处理对细胞和细胞核形态的改变有明显保护作用.DCFH-DA、Rhodamine 123染色后经流式细胞术分析及荧光显微镜观察显示,GSP抑制了Rot所致细胞内活性氧水平升高,同时明显改善Rot引起的线粒体膜电势降低;Annexin V/PI双染分析发现GSP联合处理明显抑制了Rot所致细胞凋亡.结果表明,GSP可能通过降低细胞ROS生成、恢复线粒体膜电势水平而保护细胞,抑制Rot引起的细胞凋亡,可能在防治帕金森病方面发挥作用.     

NOS在甲状腺功能低下小鼠脑中含量变化的研究

本文研究了甲状腺激素减少时,小鼠的大脑、小脑、海马、嗅脑等脑组织中一氧化氮合酶（NOS）含量的变化.采用丙硫氧嘧啶（PTU）持续灌注20日龄左右雌性昆明小鼠造成甲减模型.采用NOS的生化测定法检测甲减小鼠的大脑、小脑、嗅脑、海马等中的NOS含量;检测指标包括组织中总一氧化氮合酶（TNOS）活性,以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及结构型一氧化氮合酶（cNOS）两种分型酶的活性.生化测定法显示,甲状腺功能低下小鼠NOS含量与对照组比较在大脑、小脑和嗅脑中均出现了下降,cNOS在大脑、小脑、海马、嗅脑部位也均出现了下调.而iNOS含量在甲状腺功能低下小鼠的大脑、小脑、海马、嗅脑中却出现了上调.由此可得出,甲状腺激素的分泌异常会造成NOS含量的异常,NO信号系统可能参与甲状腺激素缺乏所致的脑损害过程.     

运动训练对大鼠肾上腺一氧化氮合酶和细胞凋亡的影响

探讨不同强度运动对大鼠肾上腺一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）和细胞凋亡的影响.采用跑台运动方式,建立大鼠有氧运动和疲劳运动模型,运用免疫组织化学streptactividin-biotin complex（SABC）法研究不同强度运动对大鼠肾上腺组织内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）和神经型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase,nNOS）及细胞凋亡蛋白（Bcl-2/Bax）表达的影响.结果表明,有氧运动组与对照组比较,肾上腺组织eNOS、nNOS、Bcl-2（B celllymphoma/leukemia-2）和Bax（Bcl-2 assaciated X protein）表达差异显著（P〈0.05）,iNOS虽略有升高,差异不显著;疲劳运动组与对照组和有氧运动组比较,大鼠肾上腺组织NOS及Bcl-2、Bax表达差异显著（P〈0.05）.表明运动可引起大鼠肾上腺NOS及Bcl-2、Bax表达的变化,且与运动强度关系密切;有氧运动可使肾上腺NOS适度增加且抑制细胞凋亡的发生;疲劳运动导致大鼠肾上腺组织NOS均过度表达,细胞发生凋亡现象.     

P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

ERK5对M1型巨噬细胞标志炎症因子iNOS、MCP-1表达的影响

目的:观察ERK5抑制剂XMD8-92对M1型巨噬细胞标志性炎症因子单核细胞趋化因子(MCP-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:常规培养巨噬细胞RAW264.7,氧化低密度脂蛋白(质量浓度为10μg/mL)和脂多糖(质量浓度为1 ng/mL)建立细胞模型,XMD8-92(浓度为2.5μmol/mL)抑制ERK5表达.实验分为空白、模型和模型+抑制剂组,分别应用RT-qPCR法和蛋白印迹法检测各组细胞MCP-1、iNOS mRNA和蛋白的表达;CCK-8法检测细胞生存率.结果:与正常组相比,模型组MCP-1和iNOS mRNA和蛋白的表达显著升高,有统计学差异(P0.01);与模型组比较,模型+抑制剂组MCP-1和iNOS mRNA和蛋白的表达降低,具有显著统计学差异(P0.01);与空白组相比较,模型组细胞生存率升高,加入XMD8-92后细胞生存率降低,有统计学差异(P0.01).结论:XMD8-92对M1型巨噬细胞的活性有抑制作用,并可抑制MCP-1和iNOS蛋白和mRNA的表达.可能通过抑制ERK5活化,抑制M1型巨噬细胞标志性炎症因子表达,减轻炎症反应.     

北五味子多糖通过ERK1/2通路对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用机制

目的观察北五味子多糖(polysaccharide of Schisandra chinensis,SCP)对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞(CFb)增殖作用,并探讨其作用机制.方法以培养的新生Wistar大鼠乳鼠CFb为实验模型,实验分为对照组、模型组、3个药物剂量组.采用胰酶消化、差速贴壁法培养CFb;四氮唑盐(MTT)比色法检测CFb增殖;羟脯氨酸(Hyp)法测定胶原含量;分光光度计测定CFb中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)水平;硝酸还原酶法和分光光度法分别测定不同干预条件下CFb培养液中一氧化氮合酶(NOS)活性及一氧化氮(NO)水平;免疫组化技术检测CFb中细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达.结果 SCP能够显著抑制AngⅡ诱导的CFb增殖(P0.05或P0.01),降低Hyp含量,提高SOD活力,降低MDA水平(P0.05,P0.01),提高NOS活性及NO水平(P0.05,P0.01),减低ERK1/2蛋白表达(P0.05,P0.01).结论 SCP可通过抑制ERK1/2信号通路提高NOS活性,并升高NO水平,增强抗AngⅡ诱导的CFb增殖能力.     

野漆树苷对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用及机制探究

目的:探究野漆树苷(Rhoifolin,RHO)对细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞炎症模型释放炎性因子的影响,并探讨其作用机制.方法:用脂多糖(0.5μg·mL~(-1))刺激体外生长良好的RAW264.7细胞24h建立体外细胞炎症模型,以MTT法测定不同浓度RHO对RAW264.7细胞的毒性作用,用Griess试剂法检测一氧化氮(Nitric Oxide NO)的含量,RT-PCR法检测细胞中肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α),白介素1β(Interleukin-1β,IL~(-1)β),白介素6(Interleukin,IL-6)的含量,采用Western Blot法检测MAPK信号通路中相关蛋白的含量.结果:与空白对照组相比,在LPS诱导下,RAW264.7细胞分泌致炎因子NO,TNF-α,IL~(-1)β,IL-6(P0.01);与模型组相比,25~100μmol·L~(-1)的RHO可明显下调LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子NO,TNF-α,IL~(-1)β和IL-6(P0.05,P0.01),并呈现良好的剂量依赖关系;野漆树苷还不同程度的抑制了Erk和JNK激酶的磷酸化.结论:RHO可以抑制LPS所致的RAW264.7细胞炎症反应,减少炎症因子NO分泌,抑制TNF-α,IL~(-1)β和IL-6mRNA的合成,抑制JNK/SAPK及Erk信号通路可能是其抗炎作用机制之一.     

钩藤中钩藤碱对肿瘤坏死因子-α诱导人星型胶质细胞炎症模型作用机制研究

目的研究钩藤中钩藤碱对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导人星型胶质细胞(Human Astrocytes,HA)的炎症模型的作用机制.方法:体外培养HA,用TNF-α诱导HA造模,将细胞分为正常组、模型组、钩藤碱组、依达拉奉组.采用噻唑蓝(MTT)法检测钩藤碱对HA增殖能力的影响,用逆转录PCR法(RT-PCR)检测一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)mRNA、白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)mRNA、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)mRNA的表达,用分光光度法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的表达,用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-mTOR,mTOR,p-Stat3和Stat3的蛋白表达.结果与正常组比较,32ng·mL-1的TNF-α对星形胶质细胞有明显抑制作用(P0.001);400μmol·L~(-1)的钩藤碱对星形胶质细胞活力有明显抑制作用(P0.001).与模型组相比,200μmol·L~(-1)的钩藤碱对模型细胞有明显的增殖作用(P0.01);钩藤碱组和依达拉奉组NOS mRNA,NO和SOD都显著上升(P0.001),IL-23mRNA,IL-6mRNA和MDA都显著下降(P0.001);钩藤碱组p-mTOR/mTOR和p-Stat3/Stat3都显著下降(P0.01).结论钩藤有效成分钩藤碱具有抑制TNF-α诱导HA炎症的损伤作用,可能是通过下调mTOR/STAT3信号通路增加氧化相关因子NOS,NO,SOD的表达,减少氧化相关因子MDA以及炎症相关因子IL-23和IL-6的表达.     

静脉注射海洛因对一氧化氮及红细胞免疫功能的影响

目的 :探讨静脉注脉射海洛因者血中一氧化氮、一氧化氮合酶与红细胞免疫功能变化的关系。方法 :检测静脉注射海洛因者血中一氧化氮、一氧化氮合酶及红细胞 C3b受体活性等水平。结果 :静脉注射海洛因者血中一氧化氮及一氧化氮合酶的含量显著高于对照组 ,治疗组与非治疗组亦存在显著性差异 ,红细胞C3b受体活性明显下降且与一氧化氮含量呈负相关 ,治疗组一氧化氮及红细胞 C3b受体活性等指标有所恢复。结论 :静脉注射海洛因影响血中一氧化氮及一氧化氮合酶的含量 ,高浓度的一氧化氮 ,可能是红细胞免疫功能低下的重要原因之一 ,戒毒有望恢复其红细胞免疫功能。