细粒棘球绦虫新疆株胆汁酸钠协同转运蛋白基因的克隆及序列分析

 从新疆株细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)原头蚴中克隆胆汁酸钠协同转运蛋白(sodium-bile acid co-transporter,EgSBACT)基因,进行序列测定和生物信息学分析。首先设计EgSBACT 基因特异性引物,用RT 及PCR 方法从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴提取总RNA,将其反转录成cDNA 后扩增EgSBACT 基因并将其克隆至原核表达载体pET30a 中,测序鉴定序列并进行生物信息学分析。结果显示,RT-PCR 扩增出一长度约650 bp 的基因,测序显示其长度为654 bp,序列与Gen-bank 公布的EUB59978.1 完全一致,其编码217 个氨基酸,预测其等电点为9.28。同源性分析发现,EgSBACT 蛋白序列与中华枝睾吸虫SBACT(GenBank:GAA57409.1)同源性最高,达到43%。进化树分析表明,细粒棘球绦虫的SBACT 蛋白与吸虫纲的SBACT 相聚集,在进化树上处于一枝,而与其他物种亲缘性较远。由此表明,本研究成功克隆出细粒棘球绦虫EgSBACT 基因。     

细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3和Eg10免疫差异的初步研究

表达纯化细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3(rEg14-3-3)和Eg10(rEg10),分别免疫小鼠,8w后进行细粒棘球蚴原头蚴攻击感染.计算免疫保护力,检测脾组织中CD4+T、CD8+T细胞亚群以及T细胞增殖情况.实验结果表明,rEg14-3-3免疫组小鼠具有85.3%抵抗细粒棘球绦虫感染的能力,而rEg10免疫组小鼠与对照组小鼠相比无免疫保护力;与PBS对照组相比,只有rEg 14-3-3免疫组的CD4+T细胞亚群的分布有明显差异,且rEg 14-3-3抗原能诱导淋巴细胞显著增殖.因此rEgl4-3-3蛋白能抑制细粒棘球蚴的生长,诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,可作为疫苗候选分子.     

青海省称多县野生狐狸棘球绦虫CO Ⅰ基因多态性分析

为进一步了解野生狐狸在棘球属绦虫感染传播的情况,搜集并解剖野生狐狸6只,对搜集的其中4株多房棘球绦虫、2株石渠棘球绦虫的线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶第1亚基（COⅠ）基因进行同源性分析.结果显示：6只野生狐狸中有2只感染多房棘球绦虫,感染强度分别为1640和839,1只感染石渠棘球绦虫,感染强度为833;线粒体DNA CO Ⅰ基因扩增得到了363 bp的目标片段,其中4株多房棘球绦虫与GenBank中检索到的基因序列（AB461417）一致性达到100％,2株石渠棘球绦虫的mtDNA CO Ⅰ基因序列与GenBank中检索到的基因序列（AB159136）一致性达到99.2％,有3处碱基置换位点.称多县野生狐狸肠道内寄生着棘球属绦虫,对其防控研究应该引起重视.     

细粒棘球蚴囊液抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应

目的 观察细粒棘球蚴囊液对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子的影响,并探讨其可能的机制。方法 培养小鼠巨噬细胞,分为四组处理：对照、囊液(2.15 mg·mL^-1)、LPS(1μg^-1mL^-1)以及LPS+囊液。刺激5 h后,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-10的表达;刺激1 h后,免疫印迹法检测STAT3和p-STAT3的蛋白水平。结果 囊液能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α的mRNA表达,却明显促进IL-10的表达。进一步发现囊液能促进STAT3信号的活化水平,而当使用STAT3的抑制剂S3I-201后,STAT3的磷酸化水平明显降低,同时回升了TNF-α的表达。结论 细粒棘球蚴囊液能抑制RAW264.7细胞炎症反应,IL-10/STAT3信号通路可能参与调控此过程。     

青海省野生犬科动物棘球绦虫感染状况调查及防控研究

为了解野生犬科动物在包虫病流行中的作用,探索野生犬科动物棘球绦虫的防控方法,通过野外收集疑似野生犬科动物粪便进行DNA宿主鉴定,粪便用蔗糖漂浮法收集虫卵,对虫卵进行DNA检测鉴定,结合动物解剖法对青海省部分地区野生犬科动物棘球绦虫的流行病学进行了调查.在3处狐狸窝附近投放驱虫药物吡喹酮,采集驱虫前后的狐狸粪便,用虫卵检...     

牛羊细粒棘球蚴病现场快速检测方法的建立及应用

建立了一种基于恒温隔绝PCR(Insulated isothermal PCR,ii PCR)技术现场检测牛羊包虫病的方法.结果显示,该方法只能检出细粒棘球绦虫,对多房棘球绦虫、肝片吸虫、细颈囊尾蚴、前后盘吸虫、日本血吸虫、金黄色葡萄球菌、伪结核杆菌无关病原不检出;检测下限为100个拷贝,重复性好.对55份牦牛源包囊样本和70份羊源包囊样本的检出率分别为61.8和4.3%,与文献报道的检测方法的符合率分别为100%;本研究建立的ii PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,从核酸提取到报告检测结果仅需1小时,操作方便,可现场使用,为牛羊包虫病的现场快速诊断提供有力的工具.     

大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究

目的 研究细粒棘球蚴与特定浓度大肠埃希菌体外共培养的条件下活性、形态随时间的变化,以及部分参与通路。方法 将羊源性原头蚴重悬计数,分为空白组、0.5麦氏浓度大肠埃希菌组(实验组),并以12、24、48、72、96 h为时间节点,使用0.1%伊红染液按照体积1∶1的比例染色2 min后显微镜下观察并计算两组原头蚴的存活率;使用活性氧试剂盒在上述时间点检测两组原头蚴体内ROS水平;在12、48、96 h分别检测Caspase-3、9;Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白的表达水平。结果 实验组原头蚴存活率随时间延长降低,在96 h降至为0%;两组原头蚴体内活性氧检测显示：实验组ROS水平明显提高,12 h最高,差异具有统计学意义(T=11.638,P<0.05),在72 h ROS水平与空白组相近;Western blot实验表明,凋亡蛋白Bax(T=4.997,P<0.05)、Caspase-3蛋白(T=6.118,P<0.05)、Caspase-9蛋白(T=3.435,P<0.05),实验组的蛋白水平大于空白组,有统计学意义。抗凋亡蛋白Bcl-2,实验组的蛋白水平小...     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

小鼠OB基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织中扩增了OB基因,并利用定向克隆技术克隆至原核表达载体pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot检测.表达产物利用亲和层析技术进行纯化.结果显示:表达的带有his标签的小鼠leptin融合蛋白,分子量约为20 ku.0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导2.5 h时,leptin融合蛋白的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上.表达产物经过纯化,纯度可达90%以上.Western-blot杂交显示,小鼠leptin融合蛋白有很强的抗原特异性.     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

人胰蛋白酶原-2在大肠杆菌中的表达、纯化与活性测定

胰蛋白酶原-2是急性胰腺炎相关的敏感而特异的标志物,并且与多种肿瘤转移的过程密切相关．对胰蛋白酶原-2基因5’端4个氨基酸的密码子碱基进行简并突变,并在其3’端连接6个组氨酸编码序列构建含重组质粒pBVTg2的大肠杆菌工程菌-pBvTg2／DH5α．重组大肠杆菌经温度诱导后获得了高效表达,重组蛋白占总菌体蛋白的20％,并以包涵体形式存在．包涵体经尿素缓冲液裂解后,通过Ni-NTA亲和树脂一步分离纯化．纯化蛋白经SDS-PAGE分析及利用anti—histidine mAb进行Western blotting分析,以及蛋白N末端测序分析,结果表明与目的蛋白特征相符合．纯化的重组人胰蛋白酶原-2经复性后能与天然人胰蛋白酶原-2的单抗antihTrypsinogen2 mAb特异结合,复性后的蛋白在肠激酶作用后测得具有74BAEEU／mg的胰蛋白酶比活力,为进行胰蛋白酶原-2单克隆抗体的制备及其检测和应用奠定了基础．     

exendin-4表达载体构建及其在大肠杆菌中分泌表达

目的:研究新型抗糖尿病药物exendin-4的分子作用机制,为exendin-4的大规模生产奠定基础.方法:采用重叠PCR法扩增出exendin-4的完整序列,并将其克隆至表达载体pET22b上,得到重组质粒pET-Exn4.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,超声破碎表达产物,Tricine-SDS-PAGE分析exendin-4表达.结果:PCR、酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pET-Exn4,Tricine-SDS-PAGE结果表明ex-endin-4基因在大肠杆菌中获得了分泌表达.结论:成功构建了exendin-4的重组表达载体并在大肠杆菌中实现分泌表达.     

SV40T/pcDNA3.1重组质粒的构建及在肝细胞中的表达

构建重组质粒SV40T/pcDNA3.1,为建立永生化肝细胞系奠定基础。pcD2质粒经BamH Ⅰ单酶切获得SV40T基因片段,并将其捕入pcDNA3.1载体,经酶切鉴定证实,SV40T基因片段已成功插入载体中,采用常规方法分离培养肝细胞,用SV40T单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,验证其在肝细胞中的表达。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

重组抑肽酶的表达纯化和活性测定

抑肽酶是一种用途广泛的丝氨酸蛋白酶抑制剂.用基因重组技术将化学合成的抑肽酶基因插入表达载体pET28a,并转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,表达产物以包涵体形式存在于菌体内包涵体纯化后经复性及CM-阳离子交换层析后,从每升培养液可获得2.4 mg抑肽酶,纯度可达90%.活性测定结果显示,重组抑肽酶可竞争性抑制纤溶酶对小分子底物S2251的水解活性.抑制常数(Ki)为(0.6±0.3)nmol/L,与天然抑肽酶的抑制活性相似.     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.