枇杷番茄红素β环化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物番茄红素β环化酶（LYC）基因的保守区序列，设计1对PCR引物，以枇杷基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增长约300bp的DNA片段，克隆人pMD-18T载体，测得该基因片段长312bp，编码102个氨基酸，属于开放阅读框的一部分，不含内含子。在GenBank中进行同源性检索表明该序列与苹果番茄红素β环化酶基因同源性为97％，由此推测这个基因属于枇杷番茄红素β环化酶基因。     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化

番茄红素是类胡萝卜素合成途径中重要的中间产物,本研究探讨了在番茄中通过RNAi手段提高番茄红素含量的依据,由Genbank中番茄红素β环化酶(Lyc-β)序列设计2对引物,通过高保真PCR扩增出2段Lyc-β基因的高度保守片段。根据RNAi的原理将该基因片段构建成为具有RNA干扰作用的植物表达载体,将该干扰载体通过农杆菌介导转化的叶盘法转入烟草中。经过PCR鉴定证明,干扰载体已经转入烟草中。     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

甘草水通道蛋白基因（GuPIP1）RNAi双元表达载体的构建及鉴定

植物水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白孔道．本文根据植物中hpRNA（hairpinRNA）的原理,以甘草质膜水通道蛋白基因GuPIP1为靶基因,在GuPIP1-cDNA序列中选择378bp作为构建RNAi的序列,经三次亚克隆,最后形成含GuPIP1-hpRNAi表达盒的双元表达载体,并转入农杆菌EHA105．     

番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.     

PCR法克隆卤虫（Artemia franciscana） Artemin基因上游调控序列

利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大为750bp的片段，将这一上游序列片段克隆到pMDl8-T载体中，以获得包括启动子、增强子等顺式作用元件在内的Artemin基因的上游调控序列，为进一步研究Artemin基因的表达模式及其功能提供依据。     

麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IPI)启动子的克隆及瞬时表达分析

本文以麻疯树基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因(JcIPI)起始密码子上游1 536bp的启动子序列.利用在线软件PLACE和PlantCARE分析表明该序列除具备TATA-Box、CAAT-Box等启动子基本元件外,还含有AuxRR-core、TATC-box、MBS、HSE等特异性元件.为确定启动子核心启动区域,构建JcIPI启动子283、550、970、1 276和1 536bp的5′端缺失片段,并将其分别驱动pBI121载体的葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,构建植物表达载体.采用农杆菌介导法转化烟草,在烟草叶片中进行瞬时表达分析.GUS酶活测定结果显示,五个启动子缺失片段都具有启动子活性,并随长度增加而增强.     

甜瓜果实特异性表达黄瓜素基因启动子区的克隆和序列分析

黄瓜素(cucum is in)是甜瓜类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶,其表达具有果实特异性.应用PCR方法从甜瓜基因组DNA中扩增出该基因自转录起始位点至上游一段长310 bp片段,并将其克隆到pUC 19载体中,序列分析表明该序列与已报道的相应序列完全相同,且具有TATA-box、CAAT-box、G-box、I-box-like和增强子元件TGTCACA等功能域,具有典型的果实特异性启动子特征.成功获得甜瓜果实特异性表达基因的启动子,为下一步实现外源基因在甜瓜果实中特异表达奠定基础.     

水稻16kDa醇溶蛋白启动子克隆及载体构建

水稻种子16 kDa醇溶蛋白是水稻种子成熟过程中,由16 kDa基因编码,16 kDa醇溶蛋白启动子调控,在胚乳中特异表达的蛋白质.以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到16 kDa启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为931 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.9%.该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Prolamin-box等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件.利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pC16 kDP.     

油葵种子特异性基因HaAP10启动子克隆及功能验证

为研究植物脂质转移蛋白基因HaAP10启动子能否在油葵种子中驱动外源基因特异性表达,从油葵(Helianthus annuus L.)基因组DNA中采用PCR技术克隆了HaAP10基因上游的调控序列964bp.序列分析结果表明,964bp核苷酸序列与报道序列同源性99%,包含TATA-box等基因表达的重要特征元件及种子特异表达所必需的核苷酸序列.将其与β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因融合构建植物表达载体,并利用花粉管通道法转化油葵获得转基因植株,通过PCR鉴定和组织化学染色进行分析.PCR扩增初步证明目的片段已整合到油葵基因组中,组织化学分析表明HaAP10基因启动子能够驱动GUS基因在种子中特异表达,而在根、茎和叶中无GUS活性.结果表明HaAP10基因上游964bp片段可驱动外源基因在油葵种子中特异性表达,具有种子特异性启动子的功能,为油葵植物生物反应器的构建提供了优良的基因资源,同时也为油葵的油脂基因工程改良提供了基因资源.     

高盐诱导特异启动子ThAVA-P3-Pro的克隆及序列分析

研究发现,一种在高盐适应中起关键作用的蛋白—液泡膜质子泵c亚基AVA-P3的表达在盐芥根部被高盐所诱导,而在拟南芥中变化不大。为进一步研究盐生植物盐芥的耐盐机制。以山东生态型盐芥(Thellungiella halophila)基因组DNA为模板,通过设计特异引物,PCR扩增得到盐芥高盐诱导特异启动子Th AVA-P3的9个不同长度的系列缺失片段,将这些片断分别克隆到PGEM-T载体上。序列分析表明,Th AVA-P3启动子的9个不同长度的系列缺失片段的大小分别为2 087 bp、1 711 bp、1 411 bp、987 bp、851 bp、769 bp、679 bp、436 bp、191 bp。与已报道的序列完全相同。生物信息学分析表明,Th AVA-P3-pro中存在包括响应与外界环境刺激、激素和其他生物胁迫等有关的22种顺式作用元件;推测这种关键耐盐基因Th AVA-P3的表达模式可能在盐芥的耐盐机制中发挥了重要作用。该研究可为进一步探讨Th AVA-P3-pro在逆境应答中的作用提供实验依据。     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

凡纳滨对虾线粒体DNA COI基因片段序列

以相应引物对凡纳滨对虾（Lito penaeus vannamei）线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（mtDNA CO I）进行PCR扩增，经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序，得到709bp的碱基片段．碱基组成A、C、G、T含量分别为198bp（27．93％）、136bp（19．18％）、129bp（18．19％）、246bp（34．70％）．与果蝇（Drosophilayakuba）的mtDNA CO I全序列比对。经分析发现：本实验获得的凡纳滨对虾mt CO I基因片段序列和Gen Bank上的同种序列（AY264901）都只是基因序列的一部分，二者之间有41bp的重叠并可拼接，拼接后的总长为1515bp．证明本实验条件下获得的mtCO I基因片段确实来自凡纳滨对虾线粒体DNA，且本实验所用引物具有通用性．     

角化细胞生长因子的获得及植物表达载体的构建

从鼠肺中提取RNA,设计相应的引物,经RT PCR扩增出角化细胞生长因子cDNA序列;插入pMD18 T载体,经DNA测序证实为KGF基因.将KGF基因经酶切后连接于植物CaMV35S启动子和NOS终止子之间,单酶切插入pBI1301植物双元表达载体,转化大肠杆菌,阳性克隆提取质粒后转化农杆菌EHA105,实现KGF植物表达载体的构建,为KGF的进一步研究奠定基础.     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

编码普通野生稻磷酸盐转运蛋白基因片段的分离与克隆

以云南普通野生稻基因组DNA为模板，根据GeneBank中登记的编码小麦高亲和力磷酸转运蛋白基因保守序列设计一对特异引物，利用多聚酶链反应技术（PCR），扩增出目标基因（cwrpt)1002bp长度的基因片段并克隆到载体pGEM-T。经DIG标记探针杂交检测初筛，限制性内切酶酶切，PCR扩增，DNA序列分析与可能氨基酸序列同源性比较，此推定的氨基酸序列与小麦，水稻，拟南芥，番茄磷酸转运蛋白同源性很高，初步认为此基因片段为普通野生稻耐低磷胁迫相关磷酸盐转运蛋白的编码基因，获得全长序列与基因表达的进一步研究正在进行中。     

sⅡ系列缺失启动子载体的构建

为检测新型sII根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sII基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段.在启动子片段的5'和3'端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sII基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体.该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sII不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能.     

马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.