矮牵牛ACS2基因正、反义重复表达载体的构建

将矮牵牛ACS2基因的正义重复和反义重复分别与植物表达载体质：pBI-121连接,构建ACS2基因的正义重复和反义重复表达载体,经PCR和酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体质粒上,为延长矮牵牛花期的基因工程研究奠定了基础．     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法，从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY），扩增产物大小为2．2kb，将扩增片段与pUCm-T连接，得到重组质粒pUCm-T-TreY，CaCl2法转化DH5α，并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a，连接后得重组pET21a-TreY，转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析，得到一条分子量约为74kDa的特异条带，同核苷酸序列所推导的值相符。     

IFI16基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为了构建可在人喉癌细胞中稳定表达 IFI16基因短发夹RNA（shRNA）的表达载体,设计合成的IFI16基因shRNA片段,连接到经BamH I和 EcoR I双酶切的pGreenPuroTM shRNA表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取几个抗性菌落,用PCR技术初步进行鉴定,经PCR初步鉴定为重组质粒的一个重组子DNA用测序进一步鉴定,测序结果显示成功构建了 IFI16基因shRNA的表达载体pGreenPuro-IFI16 shRNA 。     

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白。用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株。经PCR及Southern blot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株。抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟衣较强的抗性。     

纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定

【目的】开发适用于海藻糖生产的新型海藻糖合成酶。【方法】通过反向PCR技术,从一株纤维微菌的基因组DNA中获知海藻糖合成酶基因完整ORF序列,进而克隆得到纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS),将其与表达载体pSE380构建重组质粒后转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,通过镍柱亲和层析纯化得到纯酶并进行酶学性质测定。【结果】从纤维微菌中克隆并在大肠杆菌中成功表达海藻糖合成酶基因(CCTreS)。经纯化获得的重组酶(CCTreS)在以麦芽糖为底物生成海藻糖时,最适反应pH值为7.0,最适反应温度为45℃,40℃保温1h仍具有80%以上的相对酶活力,在pH值5.5~8.5保存24h,相对酶活力仍保留80%以上。Cu~(2+)对其有明显抑制作用。【结论】该重组酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,具有一定的研究价值和潜在的工业应用价值。     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

GST—hBTLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBTLyS（human Blymphocte stimulator）基因序列设计合成特异性引物。用RT－PCR从人外周血淋巴细胞扩增出858bp的hBLyS基因，并将其插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/hBLyS.把此重组质粒转化大肠杆菌BL21，经用IPTG诱导，表达出GST－hBLyS融合蛋白。     

hTR基因反义表达质粒构建及序列分析

从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增得到的 h TR基因的 DNA序列与所发表的序列完全一致 .构建的反义表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 p LNCX的克隆位点上 ,构成了 h TR基因的反义表达质粒     

RATS1基因对人食管癌细胞c—myc基因表达的降调…

将含有ＲＡＴＳ１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤＶ１与含有ｎｅｏ抗性基因的表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ法共转染人食管癌细胞系ＥＣ１０９细胞。结果发现：转染ＲＡＴＳ１基因后的抗性克隆细胞生长受到抑制，形态发生明显改变，并且逐渐脱落死亡。经ＲＴ－ＰＣＲ分析发现，转染后有ＲＡＴＳ１基因表达的细胞克隆，ｃ－ｍｙｃ基因表达降低，两者呈反向相关，即ＲＡＴＳ１基因表达愈高，ｃ－ｍｙｃ基因表达降低愈     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯的研究

采用RT—PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了490bp的人铜锌超氧化物歧化酶(hCM，Zn—SOD)基因的cDNA序列，进行了序列测定，结果和文献报道的一致；构建了CaMv35S启动子驱动hCu，Zn—SOD基因的植物表达载体PBICuSOD；用三亲交配法将重组质粒PBICuSOD转化到农杆菌LBA4404，转化马铃薯得到转基因植株。PCR和Southern—blot分析证明，hCu，Zn—SOD基因巳整合到马铃薯基因组中。Western blot分析表明，hCu，Zn—SOD基因在转基因马铃薯植株中得到表达。用NBT光还原法测定转基因马铃薯植株中的SOD酶活力，叶的总酶活为1066．6U／g(湿重，下同)，块茎的总酶活为10llU／g。     

Molecular cloning and expression of Pfu DNA polymerase gene and its application in long-distance PCR

A 2.3 kb DNA fragment containing Pfu DNA polA gene was amplified by PCR from total DNA of Pyrococcus furiosus and cloned into a pGEM-T vector. The recombinant clone pT-pfu was digested with Nco I and Xho I and the fragment was inserted into an expression vector pET3d-X. The Pfu polA gene was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The gene product (Pfu) was purified with heat denaturation, polyethylenemine (PEI) precipitation and Bio-rex 70 ion-exchange chromatography. The recombinant Pfu was verified by protein N-terminal sequencing. With the recombinant Pfu, large λ DNA fragments were successfully amplified in long-distance PCR.     

脱水蛋白DHN1表达载体pBV221-dhn1的构建及基因表达

以克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )为基础 ,构建脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.采用PCR技术从克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )上扩增dhn1片段 ,并引入NcoⅠ /BamHⅠ酶切位点 ,然后与 pBV2 2 1原核表达载体连接 ,得到 pBV2 2 1 dhn1表达载体 .阳性克隆经PCR和NcoⅠ /BamHⅠ酶切检测都得到 516bp的dhn1片段 ,且序列正确 .表达载体pBV2 2 1 dhn1转化宿主菌后能够表达产生相对分子质量为 2 2× 10 3的DHN1,该蛋白具有高温可溶性 .以上结果表明 ,本实验得到了高效表达的脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

Cloning the Promoter of BcNA1 from Brassica napus and Fad2 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of the Plant Expression Vector

The upstream regulatory region of a seed-specific gene was isolated from the genomic DNA of Brassica napus by PCR amplification. The cloned fragment contained 1755 nucleotides, and shared a sequence homology of 99.6% with the reported data. The coding region of oleic acid desaturase gene was then cloned from Arabidopsis thaliana. The sequencing analysis indicated that the sequence of the PCR product was just the same as reported before. In addition, the plant expression vector harboring the seed-specific promoter and trans-Fad2 gene was constructed.