云南元江普通野生稻cDNA文库注释

从元江普通野生稻cDNA扩增文库中随机挑取500个噬菌斑,通过载体环化,选择115个菌样进行测序,获得的序列,分别采用Blast、ORFfinder、UniGene和EntrezGene系统等生物信息分析软件对这些序列进行分析,结果为:与栽培稻(Oryza sativa (japonica cultivar-group))序列比较匹配碱基数>400bp的占48.45%;确定可阅读框(>100bp,具有起始和终止密码子)的占70% ;与拟南芥的功能基因比较,相似性大于60%的有38个;确定功能、代谢过程和编码蛋白部位的cDNA片段分别有17个、16个和24个.     

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME196半定量RT-PCR分析

以从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导所建的差减文库中筛选出的一个具有丝氨酸一苏氨酸激酶抗病结构域的基因（克隆号为ME-196）,用半定量RT-PCR法,以肌动蛋白（β-actin）基因为内参,研究疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME196基因mRNA的表达水平。通过ME196基因与β-actin基因PCR产物的灰度之比,确定ME196为诱导性表达,并进一步推测其为疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因,甚至为抗病基因。     

人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析

通过对平颏海蛇毒腺cDNA文库的随机测序和PCR筛选,克隆得到两种分别长为1309和1307bp的编码半胱氨酸丰富毒蛋白（cysteine-rich venom protein,CRVP）的全长cDNA序列。这两种crvp基因同源性为97％,分别编码238和199个氨基酸残基,其中包括一段相同的由19个氨基酸残基组成的信号肽。氨基酸序列分析表明,这两种CRVP蛋白与蜥蜴helothermine毒素蛋白以及台湾饭铲倩CRVP毒蛋白高度同源,而且具有半胱氨酸丰富分泌蛋白（cysteine-rich secretory protein,CRISP)家族的典型结构特征。     

利用GISH和C0t-1DNA-FISH对稻属B，C，G基因组的比较分析

为探究稻属B,C,G基因组之间的关系以及研究中高度重复序列在稻属不同物种基因组进化中的作用,利用药用野生稻和斑点野生稻的中度和高度重序列C0t-1 DNA和总基因组作为探针,对疣粒野生稻进行了比较染色体原位杂交分析.该2种野生稻的总基因组和C0t-1 DNA在疣粒野生稻染色体上信号覆盖率分别为(72.39±0.11) %,(75.60±0.18) %,(47.93±0.16) %,(55.47±0.12) %. 此外,以C0t-1 DNA的杂交信号组成为依据,对疣粒野生稻染色体组进行了核型分析.结果表明:G基因组和B,C基因组之间的关系都比较远,其原因可能是G基因组要早于B,C基因组从稻属的祖先中发生分化,并在进化过程中发生加倍、重排和基因选择性丢失等现象,形成了各自种的特异基因组成分.稻属基因组中度和高度重复序列与功能基因一样,在不同种中也存在着相当的同源性和保守性,并在进化过程中得以保存下来.药用野生稻和疣粒野生稻基因组增大的重要原因之一,可能是基因组中度和高度重复序列加倍的结果.     

杉木茎段形成层组织cDNA文库的构建

为了分离和克隆与杉木木材形成相关的重要基因,笔者以杉木2~3年生枝条,5~6月份形成层活动期的茎段形成层组织为材料,用表达型噬菌体载体ZAP构建了cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1-Blue,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。试验结果表明:初级文库的库容量达到6.1×105pfu,扩增文库的滴度达到5.2×109pfu/mL,重组率达到95%,插入片段大小在0.5~3.0 kb。     

斜带石斑β-珠蛋白cDNA的克隆和序列分析

从斜带石斑EpinephelusCoioides白细胞cDNA库随机挑取噬菌斑，做为模板，用λTriplEx5'3'长距离插入子筛选引物，进行插入片断的PCR扩增，并进行表达序列探针（ESTs)测定。从中克隆到了血红蛋白β亚基cDNA,cDNA包含长达444bp的开放阅读框，编码147个氨基酸的多肽。用www.expasy.ch网站的compute pI/MW程序计算其可能的相对分子质量为16544，等电点为6.95。其氨基酸序列与草鱼β-珠蛋白Ⅲ的同源性最高，为73.0%。在远端和近端的与血红素结合的组氨酸都是保守的，另外，与其它鱼类及蛙，鸡和人的β-珠蛋白比较，在血红素结合区及亚基结合区的氨基酸残基均是高度保守的。     

中华卵索线虫cDNA文库的构建

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)是一种宝贵的昆虫天敌,宿主广泛,其寄生率即等于宿主的死亡率,生防潜力极大.鉴于cDNA文库在保存稀有物种基因资源与目的基因筛选及其功能研究等方面的优势,实验以中华卵索线虫为材料,采用SMART技术构建其cDNA文库.实验结果表明：滴度为1.16×109 cfu·mL－1,包含6.0×106个克隆.从原始文库中随机挑16个单菌落过夜培养,提取质粒,经XhoⅠ和 PstⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳结果表明插入片段大小主要集中在0.5～2.0 kb之间,文库重组率接近100%.文库的各项指标均达要求,可用于全长cDNA的筛选,为新基因的获得及其结构功能研究提供了可靠材料,也为今后的生物防治等研究奠定了基础.     

缺铁玉米根cDNA文库的构建及蛋白和cDNA差异比较

采用异硫氰酸胍酚氯仿法分离铁胁迫玉米根总ＲＮＡ,然后采用寡聚ｄＴ 纤维素层析柱法纯化Ｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡ．用含有ＸｈｏＩ位点的ｌｉｎｋｅｒｐｒｉｍｅｒ 锚定合成ｃＤＮＡ 第一条链后,采用替代法合成第二条链,接着连接上ＥｃｏＲＩＡｄａｐｔｅｒ 以便定向重组到载体上．ｃＤＮＡ 经过ＸｈｏＩ消化和分级分离后,带有ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ粘性末端的ｃＤＮＡ 定向重组到λＺＡＰ表达载体的ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ位点上．经体外包装,重组的噬菌体转导宿主菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ,最终获得滴度为４－５ ×１０５ ｐｆｕ／ｕｇ 的λＺＡＰ 表达ｃＤＮＡ 文库．通过差异筛选法和质膜双向电泳验证了缺铁和加铁条件下ｃＤＮＡ 和质膜蛋白的差异     

棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因,运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA,mRNA逆转录后合成cDNA,经均一化处理后,SfiⅠ酶切,连接质粒载体,电转化,成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL,其重组率高达94%,插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

Construction of human and mouse brain cDNA libraries and isolation of full-length cDNAs

cDNA libraries from aborted human 3-month fetal brain,adult rat and mouse brain were constructed by using a yZAP express cDNA library construction kin.Low molecular weight fragments of the second strand cDNASA were removed by flowing through the Sepharose CL-4B column and the frractionated long,Middle,Short fragments and the combined fragments weire respectively inserted into clone vectors to construct the cDNA libraries of the brain of human 3-month fetus.The 5'ends of 1200 clones from each of human fetal brain cDNA libraries were sequenced.A total of 894 ESTs were obtained and some full-length clones were squenced.By andalyaing the se-quences,12 novel full-length cDNAs were obtained.     

兔肌肉生长抑制素基因的cDNA克隆及初步分析

以兔骨胳肌为实验材料,构建了兔骨骼肌cDNA文库,根据该基因保守序列,设计简并引物,利用RT-PCR技术,克隆了兔MSTN基因EST片段,以EST片段为探针,应用Southern杂交技术筛选文库,克隆了兔肌肉生长抑制素基因全长cDNA并在GenBank注册(注册号:AY169410).用生物信息学方法对该基因进行了比较分析,表明从氨基酸序列及进化角度兔和其他哺乳类生物的肌肉生长抑制素基因之间关系密切.     

编码普通野生稻磷酸盐转运蛋白基因片段的分离与克隆

以云南普通野生稻基因组DNA为模板，根据GeneBank中登记的编码小麦高亲和力磷酸转运蛋白基因保守序列设计一对特异引物，利用多聚酶链反应技术（PCR），扩增出目标基因（cwrpt)1002bp长度的基因片段并克隆到载体pGEM-T。经DIG标记探针杂交检测初筛，限制性内切酶酶切，PCR扩增，DNA序列分析与可能氨基酸序列同源性比较，此推定的氨基酸序列与小麦，水稻，拟南芥，番茄磷酸转运蛋白同源性很高，初步认为此基因片段为普通野生稻耐低磷胁迫相关磷酸盐转运蛋白的编码基因，获得全长序列与基因表达的进一步研究正在进行中。     

离子交换-反相色谱法脱除胸腺肽α1盐离子

分两步脱除胸腺肽α1纯化过程中引入的盐离子.采用离子交换-反相色谱法脱除胸腺肽α1中的有机盐,再以反相液相色谱法除去无机盐,低温冷冻干燥最终获得胸腺肽α1产品,纯度为99.2%,收率为92.0%,含量为99.9%。结果表明,以离子交换-反相色谱法脱除有机盐,反相色谱法脱除无机盐,最终得到合格胸腺肽α1产品,为其他多肽的脱盐提供了新的思路.     

忽地笑(Lycoris aurea)叶片cDNA文库的构建与分析

用表达型噬菌体载体ZAP构建了忽地笑叶片cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1 BLUE,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。初始文库的滴度为5.6×105pfu/mL,扩增文库的滴度为6.9×109pfu/mL,含插入片段的频率为96%,插入片段大小在0.5～2.5kb,文库质量良好。为进一步从基因组学和分子生物学方面研究忽地笑叶片发育及克隆相关全长基因奠定了基础。     

Construction and characterization of a normalized whole-life-cycle cDNA library of rice

A cDNA library with genomic complete coverage is a powerful tool for functional genomic studies.For studying the functions of rice genes on a large scale,a normalized whole-life-cycle cDNA library is constructed based on the strategy of saturation hybridization with genomic DNA using rice cultivar Minghui 63,an elite restorer line for a number of rice hybrids that are widely cultivated in China,This library consists of cDNA from 15 directionally cloned cDNA libraries constructed with different tissues from 9 developmental stages.For normalization,the denatured plasmids purified from the 15 directionally cloned libraries are mixed and hybridized with saturated genomic DNA labeled with magnetic beads in two complementary systems. Well-matched plasmids are captured from the hybridized genomic DNA and electroporated into competent DH10B E. coli for construction of the normalized whole-life-cycle cDNA library.This library consists of 62000 clones with an average insert length about 1.4kb.Inverse Northern blotting shows that this cDNA library included many rarely expressed genes and tissue-specific genes.Sequencing of 10750 cDNA clones of this library reveals 6399 unique EST s(expressed sequence tags),indicating that the non-redundancy of the library is about 59.5%.This library has been used to make cDNA microarrays for functional genomic studies.