豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究

通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.     

蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中的克隆与表达

根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N-末端氨基酸序列设计简并引物,以蚯蚓cDNA为模板,获得该组分蛋白质的部分编码序列(AF432224,GenBank 登陆号).BLAST相似性分析表明,该序列与U25643和U25648的部分序列相似性达91%, 根据5' 和3' 末端保守序列设计引物,经PCR获得全长cDNA编码序列.将该序列插入pTBY-11质粒,转化大肠杆菌,表达蛋白以包含体形式存在.     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶原基因的初步研究

从桂北五步蛇毒腺中抽提蛇毒总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一试管内进行）扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,并进行电泳检测,可见３条特异的ＤＮＡ条带,分别约为１．５Ｋｂ、１．３Ｋｂ和８００ｂｐ,利用平端连接的方法将其中的８００ｂｐＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定。     

蚯蚓纤溶酶7#组分基因在甲醇酵母中的克隆与表达

为了使蚯蚓纤溶酶(EFE)最佳活性组分EFE-7#基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得表达,构建了表达载体pPIC9K-EFE,通过对电击条件的优化,转化率达到5×103个/μg DNA.为了便于筛选阳性克隆,以该基因的原核表达产物为抗原免疫动物,获得了与天然EFE-7#组分具有相同免疫特异性的抗体.用该抗体为探针对上述转化子进行筛选,得到了上百株阳性重组子.RT-PCR和western blotting证明,EFE-7#基因在这些重组子中获得了表达,表达产物相对分子质量高于天然产物.     

枯草杆菌SBS6中一种纤溶酶的纯化及部分特性

从枯草杆菌SBS6菌株发酵上清液中分离得到电泳纯的纤溶酶，经SDS—PAGE和凝胶过滤测得其分子质量为31ku，最适pH8．9，最适温度为50oC，酶在60℃下pH5～12范围内相当稳定，Ca^2 ，Mg^2 ，Zn^2 ，Mn^2 等离子对酶的溶解血纤维活性无明显影响，Fe^2 和Fe^3 分别抑制酶活性的17％和20%。     

产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化

为了获得纯纤溶酶并探讨其酶学性质,从广泛收集的豆豉中筛选到一株具有高产纤溶酶能力的菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌.将该菌突变株DC-12N8的发酵液经离心除菌、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤,获得电泳纯的豆豉纤溶酶,每升发酵液可得到4.5mg活性酶蛋白,每克酶蛋白活力达1.18mol/s,纯度为发酵原液的53.6倍,回收率为11.7%.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,该酶是单链蛋白质,其分子质量约为28ku.     

人纤溶酶原Kringle 1基因的克隆与表达

从人肝组织中抽提总RNA，通过RT-PCR方法扩增出人纤溶酶原（plasminogen)Kringle 1片段，构建pPIC9K-K1载体，电击转化酵母，成功获得pPIC9K-K1/GS115工程菌，摇瓶发酵初步结果表明，工程菌能稳定表达可溶性的重组K1蛋白，分子量为15kd，发酵液中的蛋白含量为84.17mg/L。     

安舒克栓酶和水蛭素融合基因在枯草杆菌中的表达(简报)

安舒克栓酶(Antithromboase,AT)是本实验室从枯草杆菌N18中分离得到的具有强烈水解纤维蛋白活性的蛋白酶.研究表明,该酶具有直接纤溶和纤溶酶原激活剂的双重作用,且有较强的纤维蛋白亲和性,是极具开发价值的溶栓药物.来源于医用水蛭的水蛭素(hirudin,Hir)是凝血酶的最强有力的天然抑制剂,是极具优势的抗凝药物.但仍各有不足:安舒克栓酶只有溶栓功能,不能抗栓,不能解决血栓治疗中再栓塞的问题;水蛭素只有抗凝作用,不具溶栓功能.如果将这两种从不同途径治疗血栓的药物.通过融合     

Cloning and Characterization of Gene Promoters from Bacillus pumilus

DNA fragments obtained from Sau3AI partially digested total DNA of Bacillus pumilus UN31-C-42 are first inserted into BamHI site of pSUPV4, a promoter-probe vector. The recombinant DNA molecules are transformed into Escherichia coli cells and eight-three Kanr clones (named pSUBp1-pSUBp83) are obtained. The inserted fragments in pSUBp53, pSUBp57, pSUBp21, which showed high level of kanamycin- resistance, are sequenced and analyzed, respectively. These fragments contain some con-served sequences of prokaryotic gene promoters, such as TATAAT and TIGACA box. The promoter frag-ment Bp53 could efficiently promote the alkaline protease gene of B. pumilus expression not only in E.coli but also in B. subtilis cells.     

蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株纤溶酶的酶学性质

对蜡状芽孢杆菌Bc-05茵株的发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析所获得的纤溶酶进行性质研究.结果表明:经纤维蛋白平板法检测该酶有直接水解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用,最适作用温度37℃,最适pH=8.0,在pH=8.0条件下25℃和37℃放置24 h酶活力仍保持77.52%和78.96%,该酶体外对兔血凝块有明显的溶解作用;Ca2+,Mn2+离子对该酶具有激活作用,而Cu2+,Fe3+完全抑制其纤溶活性,PMSF,EDTA和DTT对该酶有抑制作用,说明活性中心含有二硫键、金属离子和丝氨酸;测其N端10个氨基酸序列为NH2-Val-Thr-Pro-Thr-Asn-Ala-Val-Asn-Thr-Gly,与其他生物来源的纤溶酶相比较没有同源性.     

大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达

为了对大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码的３－脱氧－Ｄ－阿拉伯庚酮糖酸－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ合成酶）进行结构与功能的深入研究,尝试了ａｒｏＧ基因在枯草杆菌中的表达。表达载体以ｐＵＢ１１０为骨架,采用了枯草杆菌热激蛋白ｇｒｏＥＳＬ基因的启动子,碱性蛋白酶ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ基因的信号肽和Ｎ－乙酰胞壁酸－Ｌ－丙氨酸酰胺酶ｃｗｌＨＢ基因的转录终止子,将ａｒｏＧ基因在枯草杆菌ＷＢ６００宿主菌中进行了分泌表达     

芽孢杆菌纤溶酶稳定性的研究

芽孢杆茵纤溶酶是一种微生物来源的新型溶栓酶，作者研究了pH，温度，金属离子及某些有机物质对该酶稳定性的影响，应用“系统数值化及数值全面反馈技术”进行了一系列系统行为控制实验，优化了酶复合稳定促进剂．同时，为研究其作为溶栓药物的应用前景，在模拟人体胃肠环境中对该酶的稳定性进行了研究，发现其在胃环境中酶活损失较大而肠道中相对稳定，有望开发为肠溶型溶栓新药．     

蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.