重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？…

目的：为用基因重组技术表达ｈＣＧ避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βｈＣＧ－ｐＰＩＣ９Ｋ,转化嗜甲醇酵母,方法：根据βｈＣＧ的ｃＤＮＡ序列设计两条引物,使上游带ＥｃｏＲⅠ酶切位点,下游带ＮｏｔⅠ酶切位点,以质粒βｈＣＧ－ＰＢＳＫＳ为模板,进行ＰＣＲ扩增反应;将所得的ＤＮＡ片段经ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切后用Ｔ４连接酶与ｐＰＩＣ９Ｋ质粒进行连接,然后导入大肠杆菌ＤＨ５α,用ＰＣＲ筛选阳性克     

重组质粒pPIC9K-pZP3α-hCGβ CTP109～145的构建

目的：为发展多特异性避孕疫苗,制备重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,用基因工程技术构建重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,方法：根据pZP3α全长和hCG 0633CTP109-145编码的DNA序列设计两对引物,通过部分重聚合酶链式反应（overlaping PCR）,扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145片断,克隆到载体质粒pPIC9K中,然后导入大肠杆菌DH5α,用PCR和双酶切反应鉴定重组质粒,并用DNA测序仪对重组质粒测序,结果：3步PCR扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145DNA片段,插入到载体质粒pPIC9K的克隆位点,获得重组pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145表达质粒,测序结果显示插入序列与设计预期完全一致。结论：重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145构建成功,为表达重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,探讨重组多特异性避孕疫苗抗生育效能的研究建立基础。     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1.PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列.并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中.因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达.     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1。PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列。并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中。因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达。     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

长片断引物反向PCR方法构建重复序列的重组质粒

构建重复序列的重组质粒比较困难,因为扩增重复序列会产生多聚物.利用长片断引物反向PCR方法构建重组质粒pET20b-C1-Xyn-C1,将碳水化合物结合模块C1连接在木聚糖酶Xyn两端,为类似质粒的构建提供新方法.第一步,以C1特异性正向引物LF、载体特异性反向引物VRP从pET20b-Xyn-C1模板上扩增C1-pET20b长片断DNA,作为第二步的正向引物;第二步,以pET20b-C1-Xyn为模板,Xyn特异性反向引物RX,正向引物与模板上pET20b同源区域匹配,阻止了模板上C1同源区域的匹配,从而抑制多聚物产生;反向PCR扩增得到线性重组质粒C1-pET20b-C1-Xyn,将此线性产物用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,得到含重复序列的pET20bC1-Xyn-C1转化子.     

低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.     

具有嗜杀质粒(killer plasmid)酵母菌嗜杀特性的初步研究

以K_2型嗜杀酵母为材料在改进Russell(1986)的嗜杀活性检测方法基础上,建立了双层平板单菌落检测法。此法可直接用于嗜杀酵母的筛选,嗜杀质粒的检测,并能在诱变后的平板上检出有嗜杀活性的营养缺陷型菌株MK_2-3:K~+,len。对K_2嗜杀特性初步研究表明,K_2型嗜杀酵母能杀死酿酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae),但对所测汉逊酵母(Hansenula spp.)无作用。嗜杀毒素产生的最适pH和温度分别为pH4.5—5.5和20—25℃,酵母菌的对数生长期嗜杀毒素达到高峰。用紫外线(UV)、溴化乙锭(EB)、亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸乙酯(EMS)进行消除K因子实验,表明亚硝基胍和紫外线对K因子具有一定消除率,而溴化乙锭和甲基磺酸乙酯未发现消除作用。     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

猪β干扰素基因17位丝氨酸突变体重组酵母表达载体的构建

根据猪β干扰素基因序列设计一对引物,并按酵母密码子的偏好性,在引物中对稀有密码子进行同义突变,即第3位的TAT基因突变为TAC,第7位的CGA基因突变为AGA,第164位的CGG基因突变为CGT。同时,利用聚合酶链式反应基因定点突变技术,把17位的半胱氨酸密码子TGT突变为丝氨酸密码子TCT,构建poIFNβSer17...     

重组β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸的定向性改造

为提高重组β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性,通过易错PCR方法对其进行突变并构建突变体文库,利用薄层层析和高效液相色谱对突变文库进行筛选,获得了突变株PGUS（M51）E,其底物特异性提高了41％。突变酶的酶学特性研究发现,该突变酶的最适pH值和温度较PGUS-E无显著变化,酶活力下降了16．86％,T。值提高了5℃;序列分析结果表明：PGUS（M51）-E共发生5处突变,其中3处发生在糖基结合域。因此,利用定向进化策略能有效提高伊葡萄糖醛酸苷酶的底物识别特异性。     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

大鼠反义转化生长因子βRII /PCDNA3.1(+)真核细胞表达质粒的构建及鉴定

构建大鼠反义转化生长因子βRⅡ/PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒.查阅文献,采用两对套式引物,运用逆转录巢式PCR技术扩增TGFβRⅡ片段并经测序鉴定,双酶切纯化PCR产物及PCDNA3.1（＋）,再将TGF β RⅡ反向插入PCDNA3.1（＋）线性质粒,即构建成TGF β RⅡ/PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒.将反义质粒转染感受态细胞JM-109,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序分析证实反义TGF β RⅡ/PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒构建成功.从而为下一步抗肝纤维化基因治疗研究奠定基础.     

SV40T/pcDNA3.1重组质粒的构建及在肝细胞中的表达

构建重组质粒SV40T/pcDNA3.1,为建立永生化肝细胞系奠定基础。pcD2质粒经BamH Ⅰ单酶切获得SV40T基因片段,并将其捕入pcDNA3.1载体,经酶切鉴定证实,SV40T基因片段已成功插入载体中,采用常规方法分离培养肝细胞,用SV40T单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,验证其在肝细胞中的表达。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a( ),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210 μg/L.     

GmGASA6基因CRISPR-Cas9载体构建及大豆的遗传转化

通过对大豆GmGASA6基因的结构分析,选择了两个靶位点构建了GmGASA6 CRISPR-Cas9的基因编辑载体.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了遗传转化,共转化外植体800个,获得了转基因阳性苗15株.通过测序证实部分T1代植株GmGASA6基因的靶位点发生了基因编辑.与野生型相比,种子萌发实验发现突变体的胚...     

一个新的用于植物转化的双元质粒载体的构建及应用

构建了一个适合农杆菌介导转化的双元T-DNA载体.载体pCNPT-Ⅱ含有与LacZ相连的多克隆位点,其分子量比常用的pBin19载体小了2.6kb.多克隆位点靠近T-DNA的右边界,植物选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因靠近T-DNA的左边界,当T-DNA从右边界向左边界依次转移时,使外源基因应先于选择标记基因整合进植物基因组,可以避免产生无外源目的基因的转化植株.以β-葡糖醛酸酶基因作报道基因构建了植物表达载体pCNPT-ⅡGUSA,经农杆菌介导转化了烟草.分子检测表明,在外源目的基因与选择标记基因共整合的频率上,pCNPT-Ⅱ构建的植物表达载体强于pBin19来源的pBI121.     

番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化

番茄红素是类胡萝卜素合成途径中重要的中间产物,本研究探讨了在番茄中通过RNAi手段提高番茄红素含量的依据,由Genbank中番茄红素β环化酶(Lyc-β)序列设计2对引物,通过高保真PCR扩增出2段Lyc-β基因的高度保守片段。根据RNAi的原理将该基因片段构建成为具有RNA干扰作用的植物表达载体,将该干扰载体通过农杆菌介导转化的叶盘法转入烟草中。经过PCR鉴定证明,干扰载体已经转入烟草中。     

单叶算子的(U+K)轨道闭包及Putnam定理

通过研究一类解析的Toeplitz算子, 引出单叶算子的概念, 并刻画了它的(U+K)轨道闭包, 从而给出这类算子集合的(U+K)不变量. 最后得到关于这类算子的Putnam定理.