红鲫促性腺激素α亚基的cDNA克隆

从红鲫(Red crucian earp)脑垂体中提取总RNA，根据鱼类促性腺激素(Gonadotropin Hormone，简称GTH)α亚基的保守性，设计并合成了一对20个碱基长的简并引物，用RT-PCR方法扩增并克隆了红鲫GTH-α亚基的两种不同的cDNA，分别命名为GTH-α1和GTH-α2。GTH-α1和GTH-α2分别由363和366个核苷酸组成，分别编码117和118个氨基酸．这两种类型的cDNA的核苷酸和氨基酸的同源性非常高，分别达到了95.0％和96．6％．但是，它们之间也有4个氨基酸的差别，而且GTH-α1有一个三联体核苷酸组成的氨基酸的缺失。聚类分析表明，GTH-α亚基在鲤科鱼类中具有高度保守性。     

鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)促性腺激素β亚基的克隆、表达和序列分析

促性腺激素(Gonadotropin Hormone, GTH)是垂体合成和分泌的促进性腺发育成熟的一种重要的糖蛋白激素(Glycoprotein Hormones, GPHs).通过RT-PCR方法从鳙(Hypophthalmichthys nobilis)脑垂体中克隆出两种促性腺激素β亚基,分别是促黄体素亚基(Luteinizing Hormone, LH)和促滤泡激素亚基(Follicle-stimulating Hormone, FSH).鳙鱼FSHβ亚基全长645bp,开放阅读框396bp,编码131个氨基酸(GenBank序列登录号:EF552360);LHβ亚基全长559bp,开放阅读框444bp,编码147个氨基酸(GenBank序列登录号:EF565164).根据鳙鱼与草鱼等鱼类及其他脊椎动物FSHβ和LHβ亚基的氨基酸序列分析表明:在鱼类中LHβ亚基具有高度保守性,而FSHβ亚基分化更快.用β-actin内参法从鳙鱼的垂体、下丘脑、心脏、肝脏和性腺等不同的组织,提取总RNA,用RT-PCR技术分析得出鳙鱼FSHβ和LHβ基因仅在垂体中特异性表达.     

鳜肌球蛋白轻链2基因cDNA的克隆及其发育表达分析

通过构建肌肉组织cDNA文库分离到鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2),基因登录号为FJ428249.MLC2基因cDNA序列全长1 206 bp,编码区长度为579 bp.MLC2基因开放阅读框编码170个氨基酸,具有EF-手相家族蛋白全部4个EF-手相结构.与已报道的其他动物MLC2相比较,所推导氨基酸序列同源性在66.3%～97.6%,其中与ca2+结合区域非常保守,7种鱼氨基酸序列同源性为100%.采用实时荧光定量PCR方法对鳜MLC2发育表达分析表明,MLC2在原肠期开始有低量表达,与原肠期相比,尾芽期、肌肉效应期和仔鱼阶段MLC2表达量随发育阶段渐进而升高.     

不同倍性鱼cdc2基因cDNA部分序列的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用3-’RACE的方法分别从异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的卵巢中克隆了cdc2基因cDNA的部分序列.选取这3种鱼cdc2 cDNA中一段长为157 bp的保守片段设计特异引物,通过Real-time PCR检测cdc2 mRNA在这3种不同倍性鱼卵巢中的表达水平,结果表明cdc2转录量随着倍性的递增而相应升高.     

日本白鲫生长激素-Ⅱ基因编码区cDNA的克隆及序列分析

采用反转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从日本白鲫脑垂体总RNA中扩增出生长激素-Ⅱ(GHⅡ)编码区cDNA，克隆到Pum-T载体上进行序列测定和分析．结果表明，克隆的cDNA的开放阅读框长度为630bp，其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽．与得到的生长激素-Ⅰ(GHⅠ)的碱基序列和推测的氨基酸序列相比，同源性分别达到96．9％和98．5％．白鲫的GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已发表的金鱼GHⅠ比较，同源性分别为98．7％和100％，白鲫和金鱼的GHⅡ碱基序列和推测的氨基酸序列同源性分别为95．7％和95．2％．     

促卵泡激素对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外发育的影响研究

通过使用改良的TCM199无血清培养系统,在96孔细胞培养板中,每孔放入一个腔前卵泡等条件下,探索添加物促卵泡激素对小鼠腔前卵泡卵母细胞体外生长发育的影响,旨在摸索一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系.结果表明：随着浓度的增加,卵泡和卵母细胞的直径都不同程度的有所增长,其中400 mIU/mL浓度组在卵泡培养的同期时间,卵泡和卵母细胞的增长值最大,与其他各浓度组之间存在显著性差异（P＜0.05）.培养到第6天时,400 mIU/mL浓度组卵泡存活率最高,为66.7％.从卵泡成腔率来看,卵泡培养到第4天时,600 mIU/mL浓度组卵泡成腔率最高,为35％;培养到第6天时,400 mIU/mL浓度组最高,为45.2％.从卵泡发生生发泡破裂、排出第一极体来看,400 mIU/mL浓度组均高于其他浓度组.结果表明,400 mIU/mL浓度组卵泡和卵母细胞的增长值最大;从培养时间上看,卵泡存活率、成腔率、生发泡破裂率、排出第一极体率都最高,分别为66.7％、45.2％、16.6％、14.3％.     

大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析

采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库,从中筛选出与RNaseⅢ有相互作用的蛋白,为研究RNaseⅢ蛋白在原核生物中的作用奠定基础.用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E.coli poly(A)Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly(A)尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA.经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRⅠ接头,XhoⅠ酶切消化产生粘性末端.用CHROMA SPIN-400column分级分离纯化cDNA片段,与p TRG XR载体连接后,电击转入XL1-BLUE MRF'菌电转感受态中.得到原始文库,经计算文库的容量达到3×10~6个克隆.用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300 bp以上,测定放大文库的滴度为:3.15×1010pfu/m L.说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆.     

枸杞果实PSY和LCYB基因片段的克隆与序列分析

利用RTPCR技术从宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）果实cDNA中分离出八氢番茄红素合成酶（Phytoene synthase,PSY）和番茄红素β环化酶（Lycopene β cyclase,LCYB）同源基因cDNA片段,分别命名为LybPsy和LybLcyb.测序结果表明,LybPsy序列长402 bp,编码134个氨基酸;LybLcyb序列长555 bp,编码184个氨基酸.BLAST结果显示,LybPsy和LybLcyb所推导的氨基酸与烟草、番茄对应序列同源性最高,分别为96%和92%,与其他物种对应区域也有86%~90%的序列同源性.     

马尾松苯丙氨酸解氨酶基因cDNA全长克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是连接植物初级代谢和次级代谢途径关键酶、限速酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、木质素等次生代谢产物的合成,在植物抗病过程中有重要意义.采用RT-PCR和RACE技术,从马尾松中克隆到PAL基因的cDNA全长.此cDNA全长2 700 bp,包括2 154 bp的完整ORF,编码717个氨基酸的蛋白,相对分子质量与等电点分别为78 200和5.81.其推导的蛋白序列与火炬松(Pinus taeda)、欧洲赤松(Pinus sylvestris)和海岸松(Pinus pinaster)的苯丙氨酸解氨酶同源性分别为98.2%、99.4%和97.8%.     

LL-37/hCAP-18基因克隆及其真核表达载体的构建

LL-37 hCAP-18是一种重要的多功能免疫分子.为探讨hCAP-18在基因治疗中的可行性,应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1细胞总RNA中成功扩增出560bp的hCAP-18基因编码区cDNA序列,构建了hCAP-18重组表达质粒phCAP-18.采用脂质体法将质粒phCAP-18瞬时转染COS-7细胞,Westernblot证实,hCAP-18能在COS-7细胞中表达.     

东北红豆杉细胞GGPPS基因cDNA的克隆

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径中的关键酶。试验采用RT-PCR技术从东北红豆杉中克隆GGPPS基因片段,将GGPPS基因片段与pMD20-Tvector连接,转化E.coli DH5α,对阳性克隆进行序列测定。生物信息学分析结果表明,获得GGPPS基因片段长度为371 bp,与GenBank中收录的GGPPS同源性达到99%。为从内生真菌紫杉醇生物合成途径中克隆关键酶基因和高产紫杉醇基因工程菌株的构建提供了借鉴。     

3个拟南芥紫色酸性磷酸酶基因的cDNA克隆及体外表达

根据拟南芥基因组测序结果，用RT-PCR的方法，克隆到3个可能的紫色酸性磷酸酶cDNA的序列(At-PAP20，AtPAP21，AtPAP22)，半定量PCR的结果表明，3个PAPs在细胞中都是组成型表达的,把PAPs的0RF分别与荧光蛋白基因序列和组氨酸标签融合，并在昆虫细胞表达系统中得到表达，荧光信号分布在细胞质中，显示这3个基因的产物在细胞质中发挥作用。     

东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。     

长白蝮蛇类凝血酶基因(Ussurase)的克隆及分析（英文）

从长白蝮蛇（Agkistrodon halys Ussuriensis）毒腺中抽提总RNA,采用RT-PCR扩增其类凝血酶基因,经全序列测定,类凝血酶基因ussurase全长为699个核苷酸,即编码233个氨基酸;根据同源性,推测它的活性中心为His40,Asp85和Ser179;二硫键为Cys7-Cys138,Cys25-Cys41,Cys73-Cys231,Cys117-Cys185,Cys149-Cys164和Cys175-Cys200。该蛇毒类凝血酶cDNA序列及推导的氨基酸序列均为首次报道。     

树干毕赤酵母(Pichia Stipitis)木糖醇脱氢酶(xyl2)基因克隆与序列分析

根据木糖醇脱氢酶基因序列相似的特点,设计1对引物获得Pichia stipitis CICC1960的木糖醇脱氢酶基因序列,此片段长度为1 092 bp,共编码363个氨基酸.利用生物信息学软件对该序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、CDS分析及二、三级结构预测.结果表明,该片段为Pich...