α-乙酰乳酸的合成及α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的筛选与鉴定

利用有机反应合成α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯，后者经NaOH水解生成的α-乙酰乳酸，可以用作测定α-乙酰乳酸脱羧酶(简称ALDC)活力的底物．通过富集，从土壤和水体中分离出100株产芽孢的菌株，其中获得VP反应为阳性的37株芽孢杆菌，通过对ALDC活力的反复测定，得到7株有较高酶活性的菌株，并根据其生理生化的特征进行了初步的鉴定，为进一步开发和利用α-乙酰乳酸脱羧酶奠定了基础．     

壳聚糖固定化α-乙酰乳酸脱羧酶的研究

采用壳聚糖作为载体，戊二醛作交联剂制备固定化α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC），优化了固定化条件。实验结果：活力1380U／g，蛋白载量98．30mg／g，比活力14．04U／mg，活性回收率37，l％，固定化α-乙酰乳酸脱羧酶最适温度30℃，最适pH5．5。     

含α-乙酰乳酸脱羧酶基因重组酿酒酵母的啤酒发酵

利用E .coli和酿酒酵母的穿梭质粒pYES2为载体 ,将地衣芽孢杆菌α 乙酰乳酸脱羧酶基因导入酿酒酵母中 ,构建了重组质粒pYEA ,实现了α 乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母菌中的表达 .α 乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母菌中的表达与菌体生长有关 .pYEA质粒在无选择压力的发酵条件下 ,仅能保持一定的稳定性 ,并具有降解α 乙酰乳酸的能力 ,但丢失率比较高 .     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（α-acetolactatedecarboxylase,ALDC,EC．4．1．1．5）基因序列,利用PCR方法从产气大肠杆菌（Enterobacter aerogenes）中克隆到0．8kb的DNA片段,经DNA序列分析表明该DNA片段为ALDC基因．将该片段插入到原核表达载体pBV220中,获得表达质粒pBVEDAD,转化大肠杆菌DH5α（Escherichia coli）,经热诱导后,通过SDS-PAGE分析和酶活测定,结果表明ALDC获得了高效表达.重组细胞表达的ALDC酶活是出发菌产气肠杆菌（Eaerogenes）的1100倍．DH5α（pBVEDAD）在无选择压力下37℃连续培养60代,在42℃下热诱导5h未见质粒丢失．     

α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌发酵培养基碳源与氮源的优化

对枯草芽孢杆菌3226-5进行碳源、氮源的优化.分别选取单糖、二糖、低聚糖、多糖等7种碳源,以及有机氮和无机氮等9种氮源进行单因子实验,并通过正交试验优化出碳源、氮源的最佳组合.结果表明,以25 g/L C2为碳源,12.5 g/L N1,7.5 g/L N2,5 g/L N5,8 g/L N酸为氮源的培养基,酶活比原培养基提高了2.73倍.     

α—乙酰乳酸脱羧酶产生菌的筛选

为降低啤酒生产中双乙酰的含量,从不同土壤中分离出１２４株芽孢杆菌,经过用不同发酵培养基和啤酒中双乙酰降低试验,反复筛选,得到一株初产α－乙酰乳酸脱羟酶活性较高的地衣芽孢杆菌Ｈ６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｈ６）。认为该菌株所产酶对啤酒生产有应用价值。     

α-乙酰乳酸脱羧酶的提取条件与应用研究

从ＢＤ－５菌株中提取α－乙酰乳酸脱羧酶，为提高酶的得率，探讨了破壁方法、除杂蛋白、硫酸铵沉淀提取粗酶等的条件，以及提取过程中酶的损失情况和菌体存放时间对酶活力的影响等。结果表明：该菌株的菌体用超声波破壁、５０％饱和度硫酸铵除杂蛋白，８０％饱和度硫酸铵提取粗酶效果较好，菌体存放时间过长，酶活力明显降低。将用该菌株提取的酶应用于啤酒发酵中，证明有明显的降低双乙酰的效果。     

α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的分离与筛选

从土壤中分离到４９８株细菌，经过不同培养基的反复筛选，得到两株产α－乙酰乳酸脱羧酶酶活性较高者，而且产酶水平比较稳定     

地衣芽孢杆菌高α-乙酰乳酸脱羧酶活力菌株的筛选

以从土壤中分离出的9株地衣芽孢杆菌为源菌株,通过α-乙酰乳酸脱羧酶活力实验发现BL-4的产酶活性最好,通过UV和NTG对BL4进行复合诱变,获得了一株产酶活性比出发菌株BL-4高1.22倍的α-乙酰乳酸脱羧酶高产菌株,并研究了该菌株的最佳发酵产酶条件是培养温度30℃、发酵时间36 h、发酵液起始pH 6.5。     

高密度培养基因工程大肠杆菌生产α-乙酰乳酸脱羧酶

在 30 0 0 L 发酵罐中 ,利用分批补料培养技术高密度培养含分泌型重组质粒 p ETGAU- 10的大肠杆菌TG1,生产α-乙酰乳酸脱羧酶。通过控制发酵条件 ,发酵液的细胞密度 (OD60 0 )可达 30 .5 ,且胞外α-乙酰乳酸脱羧酶活力最高达 890 U .ml- 1 ,达到较为理想的工业化生产的要求。     

含α—乙酰乳酸脱羧酶基因重组酿酒酵母的啤酒发酵

利用Ｅ．ｃｏｌｉ和酿酒酵母的穿梭质粒ｐＹＥＳ２为载体,将寻衣芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶基因导入酿酒醇母中,构建了重组质粒ｐＹＥＡ,实现了α－乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母菌中的表达。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中的应用研究

论述了α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产发酵过程中的形成机理及应用。实验表明：采用在发酵过程中添加α-乙酰乳酸脱羧酶控制双乙酰含量能收到较为明显的效果。     

离子注入选育α—乙酰乳酸脱羧酶菌株

采用离子注入技术对一株产α-乙酰乳酸脱羧酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus     

地衣芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶的纯化及酶学性质

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheni formis）AS10106α－乙酰乳酸脱酸酶经硫酸沉淀，聚乙二醇沉淀，DEAE－Sepharose Fast Flow离子交换，Gigapite K-100S柱层及SephadexG－100分子凝胶过滤柱等分离纯化步骤，得到SDS－PAGE电泳纯，α－乙酰乳酸脱羧酶的比活提高了53．5倍。对该酶性质的研究表明，酶单亚基分子量为32Kda，等电点为4．5；该酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为6．0，对热（40℃以上）敏感。在pH5．0－6．5之间稳定。酶活不需要金属阳离子，Cu^2 、Co^2 强烈抑制酶的活性。摇瓶实验表明，纯化的地衣芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶能明显降低双乙酰的形成并缩短其还原时间。     

地衣芽孢相菌高α—乙酰乳酸脱羧酶活力菌株的筛选

以从土壤中分离出的9株地衣芽孢杆菌为源菌株，通过α-乙酰乳酸脱羧酶活力实验发现BL-4的产酶活性最好，通过UV和NTG对BL-4进行复合诱变，获得了一株产酶活性比出发菌株BL-4高1.22倍的α- 乙酰乳酸脱羧酶高产菌株，并研究了该菌株的最佳发酵产酶条件是培养温度30℃，发酵时间36h，发酵液起始pH6.5。     

α─乙酰乳酸的制备及测定

由乙酰乙酸乙酯甲基化制奋α－甲基乙酰乙酸乙酯，用四乙酸铅氧化α－甲基乙酰乙酸乙酯生成α－乙酰氧基－α－甲基－乙酰乙酸乙酯，再经ＮａＯＨ水解生成α－乙酰乳酸。     

产α-ALDC的枯草芽孢杆菌原生质体融合条件

通过双亲灭活原生质体融合技术对2株产α-乙酰乳酸脱羧酶的枯草芽孢杆菌3226-5和V-20进行原生质体融合.初步探讨了2菌株较适宜的融()条件.对获得的几百株融合子进行酶活比较,从中得到20株酶活比双亲高的菌株.     

过渡金属盐类对α-乙酰环己酮选择还原产物的影响

以α-乙酰环己酮为原料,在不同金属离子添加剂存在下,研究NaBH4对羰基的选择性还原．结果发现当单独使用NaBH4时,两个羰基同时被还原;当加入金属Cd^2 时,得到产率为78％的1’-羰基被还原的产物4;当加入金属Ce^3 时,得到产率为42％的1-羰基被还原的产物2及产率为34％的1’-羰基被还原的产物3,金属离子Bi^3 、Ni^2=及CO^2 对α-乙酰环己酮的选择性还原没有影响．     

N'-(4,5,6-三取代嘧啶-2-基)-α-氯乙酰脲的合成及生物活性测定

合成了9种含多取代嘧啶环的α-氯乙酰脲,其中8种为新化合物.结构经IR,1H NMR,MS和元素分析测试而确证,初步生物活性测试结果表明：标题化合物具有优良的生物活性,且嘧啶环上取代基的性质对此类化合物影响很大,含4羟基取代嘧啶环的标题化合物具有较好除草活性,而含4氯取代嘧啶环的化合物一般具有一定的植调活性.     

以天然冰片为手性源的α-取代乳酸的不对称合成

以天然丰产的冰片为手性源与非手性的丙酮酸进行酯化反应生成手性丙酮酸冰片酯,该酯与格氏试剂进行Grignard反应,选择性地得到指定构型过量的α-取代乳酸.