猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行Western blot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白的可溶性表达

利用原核表达系统构建猪圆环病毒2型病毒(PCV2)衣壳蛋白.首先构建具有谷胱甘肽转移酶标签的重组质粒p GEX4T1-ORF2,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,表达并纯化得到可溶性的融合蛋白.进一步通过纳米粒度仪及免疫印迹等技术,分别研究了PCV2蛋白的粒径分布以及免疫原性.实验结果表明,BL21-p GEX4T1-ORF2菌株构建成功,能够可溶性地表达猪圆环病毒2型病毒衣壳蛋白,且蛋白具有免疫原性.     

酵母重组表达PCV2病毒样颗粒的纯化工艺

猪圆环病毒(PCV)是一种引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道综合征及繁殖障碍的病毒,已经成为危害养猪业最主要的病原之一,而接种猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制猪圆环病毒相关疾病最有效的措施.利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus,KM)表达猪圆环病毒PCV2Cap的产量可达2g/L,高于其他表达系统的产量,并且重组表达的Cap蛋白在胞内能高效自组装成病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs).酵母细胞破碎之后样品中含有大量的微小的细胞碎片,高速离心澄清难以分离,影响了VLPs的得率、纯度以及澄清度.本研究考察了超声波破碎、玻璃珠研磨破碎以及高压均质破碎等不同破碎方法,发现1 300bar高压均质法对重组表达PCV Cap蛋白的马克斯克鲁维酵母破碎效果最佳.在此基础上,检测添加有机溶剂、表面活性剂和化学絮凝剂的处理效果,发现添加1%(质量分数)Triton X-100对酵母破碎菌液具有65%以上的浊度降低率,处理后样品可直接用于离子交换层析,得率大于92%,HPLC纯度大于85%.     

猪2型圆环病毒福建析的全基因组克隆与序列分析

根据已发表猪2型圆环病毒PCV2序列设计两对特异性扩增引物对福建龙岩市某规模化猪场疑似PCV2感染病例进行PCV2的检测与全基因组克隆,经测序与序列拼接,获得了PCV2福建株全基因组序列PCV2-LY.序列分析结果表明,PCV2-LY全长1767 bp,与国内外各分离株同源性在95.1 %-98.0%之间,ORF1氨基酸同源性在97.1%-99.6%之间,而ORF2氨基酸同源性在92.7%-99.1%之间     

新型PCV2衣壳融合蛋白在HEK293F细胞瞬时表达研究

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）衣壳（Capsid）蛋白是制备抗猪圆环2型病毒亚单位疫苗的有效免疫抗原,能在大肠杆菌及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中获得表达,然而在哺乳细胞中的表达研究仍然缺乏。瞬时表达条件考察结果显示,采用宿主HEK293F细胞及PEI-40kDa转染试剂能获得35%病毒PCV2 Capsid基因细胞转染效率。转染试剂PEI(Polyethylenimine)与DNA比例差异会影响复合物形成大小及形态,复合物形成15～80 nm颗粒有利于转染效率的提高。实验以免疫逃逸型猪圆环病毒2b型NDSU41513病毒株,设计了新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-Fc(pig) protein(PCFP)分子。在3 L反应器中成功实现了HEK293F细胞瞬时表达PCFP,表达水平达到3.8 mg/L。PCFP蛋白能够自主装形成约为41 nm类病毒颗粒,诱导小鼠机体内产生强烈的体液免疫反应,具有很高的应用潜力。     

Ⅱ型猪圆环病毒ORP2基因的原核表达与初步应用

Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原．本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORP2为模板，扩增截短的ORP2（tORF2）基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒pGEX-tORP2并转化大肠杆菌BL21（DE3）．经SDS-PAGE及Western blot鉴定，成功表达了谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的tORP2，重组蛋白分子量约为45ku，表达量约为菌体总蛋白的20％，重组蛋白具有良好的免疫学活性．用tORP2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）阳性猪血清进行Western blot检测，有4份（20％）血清显示PCV2抗体阳性，说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象．本研究初步证明表达的tORV2重组融合蛋白可以应用于临床检测．     

猪圆环病毒2型Cap蛋白B细胞表位的预测及鉴定

利用生物信息学技术和原核表达系统,筛选猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白(Cap)的B细胞表位,为进一步揭示PCV2的免疫调控机制提供研究依据.运用生物信息学软件预测PCV2 Cap蛋白的亲水性、表面可及性、蛋白柔韧性、抗原性和B细胞线性表位;根据预测结果,初步确定Cap蛋白潜在的B细胞线性表位主要位于58~66、79~91、151~162、174~189、204~213和221~233位氨基酸.设计特异性引物,扩增Cap蛋白潜在表位区域基因,并克隆到p ET32a(+)原核表达载体上,转化至表达菌BL21(DE3)plys S中,在IPTG诱导下表达目的蛋白;利用PCV2阳性血清鉴定Cap蛋白的B细胞线性表位,筛选出3个能与血清结合的肽段,即Cap77-95、Cap174-189和Cap221-233;对获得的肽段进行在线同源比对,发现3个片段均为PCV2 Cap蛋白的特有序列,有可能成为PCV2的特异性表位.     

猪圆环病毒的分子生物学特性及诊断方法

猪圆环病毒(PCV)病是近年来阻碍养猪业发展的重要传染病,PCV因而成为各国学者的研究热点.本文就猪圆环病毒的基因组结构与功能,主要的编码蛋白质及其功能,分子生物学诊断方法等领域的最新研究进展进行了综述.     

288株猪圆环病毒的序列比较及遗传进化分析

目的为进一步了解猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)的遗传进化规律,为该病的预防和控制奠定基础。方法对来自世界各国的26株PCV1和262株PCV2的全序列用生物软件进行了核苷酸的同源性比较,并对其ORF1和ORF2进行了核苷酸和推导氨基酸的比较。结果从核苷酸水平来看,PCV1与PCV2明显分为两支,PCV1间分布没有规律,而PCV2间又分为以来自美国、加拿大、澳大利亚的序列为代表的亚型Ⅰ和以来自法国和新西兰的序列为代表的亚型Ⅱ;但从氨基酸水平来看,其分型并没有规律可循。从遗传进化树可以看出,PCV2的分布并没有地域性和时限性。数据统计显示,尽管相隔近十年之久,但其同源性并没有发生太大的改变,可见PCV2相当保守。另外对PCV2的碱基和氨基酸突变位点进行统计发现,PCV2序列间更倾向于碱基的颠换,但并无单个碱基和氨基酸的偏好性。结论PCV2相对保守,地域性和时限性分布不明显。     

猪细小病毒血清学检测方法的建立

目的建立猪细小病毒血清学检测方法。方法用抗猪细小病毒的猪源性血清,通过IFA和IEA两种方法,首先将阳性血清吸附PK-15细胞抗原,以排除非特异反应,通过对阳性血清及3种二抗(其中IFA以FITC标记的抗猪IgG抗体,IEA分别以HRP标记的抗猪IgG抗体和SPA-HRP作为二抗)进行浓度梯度滴定,确定最佳工作浓度,并比较三种反应体系的敏感性。结果IFA最高能检测出PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型中1个TCID50,而其它两种反应体系均只能检测100个TCID50。结论间接免疫荧光检测方法比其它两种方法敏感性更高。     

二重正交设计用于多重PCR条件优化

以猪圆环病毒Ⅰ,Ⅱ（PCVⅠ,PCVⅡ）为材料,探索多重PCR（multiplex PCR）最佳反应体系.结果表明,两次正交实验共34次反应,就获得了PCVⅠ,PCVⅡ多重PCR扩增的最佳条件组合,所得优化条件稳定,重复性好,说明正交法是一种快速,高效,经济的多重PCR条件优化手段。     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株ORF5基因抗原表位克隆表达及其免疫性研究

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株(PRRSV-SCM)囊膜糖蛋白GP5的免疫原性,利用RT-PCR方法从PRRSVSCM株ORF5中扩增大小为231bp的目的基因并构建表达载体PET32-GP5,将其转入大肠埃希菌Rosetta,运用IPTG通过条件优化诱导其表达.检测结果表明:最佳诱导条件为IPTG浓度1mmol/L在37℃下作用5h,表达大小约28kU的融合蛋白.通过Western-blot和间接酶联免疫吸附试验检测表达蛋白,结果显示该原核表达的融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生反应,证明该蛋白具有免疫反应性.这为将来研制检测试剂盒以及后续研究PRRSV亚单位疫苗提供了重要依据.     

SARS病毒的S1蛋白基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

为了建立方便、敏感和特异的SARS病毒血清学诊断方法,利用PCR扩增,克隆了SARS冠状病毒S蛋白基因中从第68～918位碱基的基因序列(S1蛋白).并通过pGEX-4T1表达系统在大肠杆菌BL21中高效表达了SARS病毒S1蛋白,用超声波破碎菌体及用不同浓度的尿素洗涤包涵体,纯化了S1蛋白,纯度可达75%以上.以在E.coli高效表达的S1蛋白为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG为二抗,建立了检测SARS抗体的间接ELISA方法.经检测,筛选出最佳反应条件为5μg/孔.用纯化的E.coli表达的抗原包被酶标板,用5 g/L的小牛血清进行封闭,以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清.实验表明,应用表达的蛋白作为诊断SARS抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点.     

传统抗原、重组抗原检测啮齿类动物病毒的ELISA法敏感性和特异性

酶联免疫吸附试验 (ELISA)是一种常用的检测啮齿动物血清病毒抗体的方法。用于检测血清抗体的抗原可是用常规方法制备的全病毒或是在原核或真核系统中表达的重组抗原蛋白。利用杆状病毒表达系统已获得细小病毒、沙粒样病毒和冠状病毒的带有His标记的重组病毒抗原。重组抗原在昆虫细胞中表达裂解后 ,可用色谱法提纯。提纯的抗原用来包被 96孔ELISA板。用细小病毒非结构蛋白 (NS 1) ELISA法检测啮齿动物血清 ,在检测的 345 7份样本中有 88份 (2 5 % )NS 1抗体阳性 ,9份 (0 3% )为非特异性反应。虽然NS 1ELISA检测NS 1抗体具有…     

内蒙古部分地区猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的血清学调查

应用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法对内蒙古部分地区猪场的182份猪血清进行猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的抗体检测,其中包括母猪、种公猪、哺乳仔猪、生长育肥猪、保育猪.平均阳性感染率为39.6%(72/182),母猪阳性感染率为44.9%(22/49),种公猪阳性感染率为73.7%(14/19),生长育肥猪阳性感染率为38.8%(19/49),保育猪阳性感染率为40.5%(17/42),哺乳仔猪全部为阴性(15).实验检测结果证实,内蒙古地区养猪场存在猪圆环病毒II型(PCV-2)感染,而且比较严重.     

乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法的建立

目的建立乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法,应用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。方法滴定病毒TCID50,筛选JEV敏感细胞,依据国标IFA法制备抗原片,并进行特异性、敏感性和稳定性试验。结果选取BHK21细胞作为JEV敏感细胞,病毒感染力滴度(TCID50)为10-8.9.mL-1;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;稳定性和敏感性试验显示,不同时间IFA检测灵敏度均为1∶2560;可检测到的病毒滴度最低为10-6.5.mL-1。结论建立的IFA法敏感性、特异性强,稳定性好,可用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。     

对虾白斑综合征病毒结构蛋白基因vp95表达时序分析及其抗体的制备

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是造成养殖对虾病害的主要病原,其300kb的双链环状DNA基因组共编码532个开放阅读框(open reading frames,ORF).蛋白VP95是WSSV的结构蛋白,在病毒囊膜蛋白和核衣壳中均有分布,由ORF wsv442编码,基因全长2 400bp.首先对基因vp95的表达时序进行分析,证明该基因属于晚期基因.为了更深入地研究该结构蛋白的功能,选择中间编码200个氨基酸的片段(1 051~1 650nt)进行克隆表达.此片段被克隆到pET-His载体上,构建好的质粒转化入表达菌株大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21(DE3),经IPTG诱导后,收集细菌,超声破碎后,将含有可溶性表达重组蛋白的上清用Ni 2+-NTA agaros纯化.纯化的重组蛋白HisVP95-M200免疫小鼠,制备抗血清.为了去除血清中的杂质,用HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)亲和层析纯化柱子纯化血清中抗蛋白VP95的抗体.Western blot分析显示,未纯化的血清和纯化的抗体对病毒粒子中蛋白VP95都有很高的效价,并且具有严格的专一性.为进一步研究VP95蛋白在病毒粒子的包装中的作用,以及其在病毒的入侵过程中的功能奠定了良好的基础.     

H3N2SIV河南株非结构蛋白1(NS1)重组的纯化及Dot-ELISA的建立

为建立鉴别猪流感病毒感染猪和灭活疫苗免疫猪的诊断方法,利用pET-28a载体在大肠杆菌BL21中表达H3N2 SIV河南株NS1,并通过Ni2+-NTA亲和色谱法纯化His-NS1融合蛋白.用SDS-PAGE,Western blotting和Dot-ELISA分析纯化蛋白,表明重组NS1能与猪流感病毒感染猪血清进行特异性反应,而不与灭活疫苗免疫猪血清反应.结果表明重组蛋白能作为区别猪流感病毒感染猪和灭活疫苗免疫猪的诊断抗原,为控制猪群中的流感病毒奠定了基础.