三种血液基因组 DNA 提取方法的比较研究

摘要: 目的 比较采用 3 种不同 DNA 提取方法提取豚鼠血液基因组 DNA 之间的差异。方法 分别用新鲜抗凝血 NaI 手提法、血凝块手提法和试剂盒 DNA 提取法提取 20 只豚鼠血液基因组 DNA,用分光光度计测定、琼脂糖凝胶 电泳、PCR 扩增等方法对提取的 DNA 片段的完整性、浓度、纯度和用于 PCR 扩增的效果等方面进行比较研究。结 果 新鲜抗凝血 NaI 手提法提取的 DNA 完整性、浓度和纯度均为最高; 血凝块法提取的 DNA 浓度和抗凝血提取的 DNA 浓度接近但纯度最低,有一定程度的断裂和降解; 试剂盒法提取的 DNA 浓度最低,纯度和完整性处于中间,但 三种方法提取的 DNA 都可用于 PCR 扩增反应。结论 3 种方法都可以提取基因组 DNA 并且所提取的 DNA 均能 满足后续 PCR 扩增实验的要求,但每种方法各有利弊,可根据具体的条件选择适宜的方法。     

3种提取淡水涡虫基因组DNA方法比较

分别用试剂盒法、改良的CTAB法、改良的酚-氯仿抽提法提取活体涡虫和95%酒精固定的涡虫标本的基因组DNA.结果显示:试剂盒法提取的基因组DNA质量最好,主要表现在分子完整,几乎无降解,并且该方法所得DNA的产率也比另外两种方法的产率要高,试剂盒法是最适合涡虫基因组DNA制备的方法.相同起始物质量条件下,3种方法从活体涡虫中提取的DNA量和纯度均高于95%酒精固定的涡虫标本,但试剂盒法提取95%酒精固定半年以上的涡虫标本,所得DNA产率较高、质量较好,可满足PCR扩增等分子生物学实验的要求.     

不同动物肌肉组织中DNA提取方法研究

实验目的旨在从三种提取方法中筛选出一种经济适用、操作简单、快速且能满足后续PCR扩增检测技术的动物肌肉组织中的DNA提取方法.分别采用SDS法、试剂盒法、异硫氰酸胍法提取猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、草鱼肉的生鲜肌肉组织以及高压肌肉组织的基因组DNA.通过酶标仪、琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行质量检测,然后根据五种动物的线粒体细胞色素B基因(cytb)保守序列设计特异性引物,进行PCR扩增结果来验证方法的可行性.结果显示,异硫氰酸胍法在生鲜和高压肉中提取DNA的浓度和纯度高于SDS法,且此方法经济适用、操作简便、快速,所提取DNA质量能满足后续PCR实验的要求.     

一种快速的重组农杆菌PCR鉴定方法

建立一种快速的重组农杆菌PCR扩增鉴定方法,采用煮沸法处理重组农杆菌,使农杆菌高温裂解,释放质粒DNA,直接进行PCR扩增反应,检测目的基因片段.结果表明,重组质粒PCR扩增效果较好,目标条带较为明显.通过煮沸重组农杆菌,进行PCR扩增反应鉴定质粒DNA,不仅实验操作简单安全,缩短实验时间,并且避免了酚、氯仿试剂在提取质粒DNA过程中的残留对后续分子鉴定质量的影响.     

微量苔藓样品DNA提取实验方案改良

苔藓植物个体微小，为得到一种适于苔藓微量样品使用的DNA提取方案，首先对前人提取植物DNA的方法进行了筛选；其次对所选择的3种适于提取苔藓样品DNA的方法——CTAB法、尿素法和磁珠法进行了改良；最后通过使用上述3种改良方法对牛角藓Cratoneuron filicinum植物样品总DNA进行提取，并比较了提取效果、提取时间和费用.结果显示：3种改良方法均可从2 mg干燥牛角藓材料中提取总DNA并得到阳性PCR结果.其中，改良磁珠法提取的DNA浓度较高，提取过程时间短，但成本高于其他2种方法.改良CTAB法提取的DNA浓度低于磁珠法，且实验耗时长，但DNA纯度较高，且实验成本仅为磁珠法的5%.PCR实验显示改良磁珠法与改良CTAB法的扩增成功率均为100%,而改良尿素法的扩增成功率仅为75%.认为改良磁珠法与改良CTAB法均可作为微量苔藓样品DNA提取的优选方案.     

内蒙古荒漠草原土壤微生物DNA提取方法的研究

利用三种提取方法从内蒙古荒漠草原土壤样品中提取了土壤微生物DNA,得到的DNA片段长度在23 kb以上,提取效果较好无降解.采用试剂盒直接纯化、凝胶回收试剂盒纯化、玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化这三种方法对粗提液进行纯化,结果显示:凝胶回收试剂盒纯化后DNA纯度最高,试剂盒直接纯化可得到较纯的DNA,而玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化的效果不佳,不宜进行后续的PCR扩增.以纯化的土壤微生物DNA为模板扩增了细菌16SrDNA,扩增产物分子量为1.5kb左右.通过比较研究提出了一种适合于从荒漠草原土壤中进行微生物DNA提取、纯化及PCR扩增的有效方法.     

大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测

采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.     

几种榕属(Ficus)植物标本的DNA提取及PCR扩增

植物标本作为一种非常重要的DNA资源受到越来越多的关注.由于其储存时间久远及储存手段局限,使得植物标本DNA提取和扩增相当困难.本研究以桑科榕属的9个种作为研究对象,采用4种DNA提取方法,比较其产物的数量和质量,并将所提取的DNA作为模版进行PCR扩增ITS和trnL-F片段.通过比较,得出以下结论:①标本的制作和储存条件对于植物标本DNA的质量有重要影响;②改进的CTAB法对于桑科榕属植物的DNA提取最为适合;③DNA模版的质量较之其他因素对PCR扩增的影响更大,适当缩短扩增片段的长度对实验的成功是至关重要的.     

唇鱼骨基因组DNA提取与ISSR-PCR的优化

以唇鱼骨为材料,分别采用4种不同方法(CTAB法、SDS法、ROSE法及试剂盒)提取基因组DNA,并对影响PCR反应的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度等主要因子进行了优化,建立了适合唇鱼骨基因组DNA的ISSR-PCR反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约60 ng模板DNA,1.2 U Taq酶,0.4 μrnol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,2%甲酰胺.结果表明,利用优化反应体系对4种不同方法提取的DNA进行PCR扩增,均能得到较好的PCR扩增条带,以试剂盒法最佳,为淡水溪流性同属鱼类遗传多样性分析奠定了技术基础.     

一种简便高效的古代动物毛皮DNA提取方法

采用试剂盒QIAamp DNA Mini Kit从距今4000年前新疆小河墓地出土的黄牛毛皮中提取出古DNA,并对黄牛线粒体D-loop区部分片段进行了PCR扩增和序列测定.结果表明:所提取的古DNA真实可信;且该方法简便、高效,适用于古代动物毛皮DNA的提取.     

生长条件对黄瓜线粒体类质粒稳定性的影响

“津新密刺”等一些黄瓜品种的线粒体中存在主基因组以外的3种环形DNA类质粒pC1、pC2和pC3。改变植株生长的温度、pH或以蔗糖溶液代替无菌水培养黄瓜植株，电泳均能检测到上述3种类质粒。应用ImageMaster VDS系统对各类质粒电泳带的密度进行扫描，通过计算3种类质粒的相对拷贝数及类质粒之间的拷贝数比值，分析不同生长条件对黄瓜类质粒稳定性的影响。结果表明，上述3种培养条件均对黄瓜线粒体类质粒的拷贝数有影响，其影响的程度因类质粒而异，pC3与pC1和pC2相比对环境改变更敏感，提示类质粒间的这种差异可能是类质粒复制方式不同引起的。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2 金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200 mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.     

青菜花粉管通道法导入外源DNA的研究初报

采用花粉管通道法，将青菜株系７５Ｆ５、１４号大白菜、紫阳等三个品种的总ＤＮＡ及质粒ｐＡｃｔ１－Ｄ ＤＮＡ导入青菜６０５品系，收获青菜种子。种子发芽后分别提取约两周苗龄的小苗总ＤＮＡ，并经ＥｃｏＲⅠ酶切，以ｇｕｓ基因片段为探针做子杂交，证实了外源ｇｕｓ基因已整合到青菜６０５品系中；田间观察还获得了一株与供体大白菜花形相似的变异株。     

福建省桫椤科植物的分子分类学研究

桫椤科科下等级设立长期以来存在一定的争议，以福建省内5种桫椤科植物刺桫椤（Alsophila spinulosa(Hook,)Tryon）、黑桫椤（Gymnosphaera podophylla(Hook.)Copel.）、针毛桫椤（G.metteniana (Hance)Tagawa）、粗桫椤（G.hancokii (Copel,)Ching）、牛姆林桫椤（G.niumulinensis Li,Chen et Deng）（新拟）为材料，采用改进的CTAB法获得了纯度较高，得率高，片段完整（片段大小均大于23kb）的基因组DNA，并运用RAPD技术对这5种桫椤进行了遗传多样性分析，从40个10－mer随机引物中筛选30个有效引物，产利用这30个有效引物共扩增出1073条DNA带，利用UPGA法以桫椤科的5个种的种间亲缘关系进行聚类分析，得出5个种的DNA分子分类系统图。结果表明，可以分为毛桫椤、棘桫椤和黑桫椤3组，平均遗传距离为0．61，符合属间的关系，从而确定了RAPD技术用于桫椤植物分子分类研究的可行性。结合前人在形态解剖学方面的工作，提出这5种桫椤科植物可以分为3个类群，即刺桫椤类、黑桫椤类和针毛桫椤类，并提供了3个类群的检索表。     

pQE30-bgln原核表达质粒的构建和鉴定

构建重组原核表达质粒pQE30-bgln使之可以在大肠杆菌中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以克隆质粒pUCP67为模板,用降落PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln).利用原核表达载体pQE30构建pQE30-bgln重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后序列情况.PCR结果显示扩增片段2.2 kb,与预期相同.重组质粒酶切后显示其大小约5.6kb,大小及酶切图谱与预期相同.经测序发现插入片段读码框正确.可用于原核表达的pQE30-bgln质粒构建成功.     

黄瓜随机扩增多态DNA(RAPD)研究初报

以异丙醇沉淀法提取的10个黄瓜亲本叶片的总DNA为模板,进行28个10-mer随机引物的RAPD分析,共产生252条带,其中10个引物共产生出21条多态性带,其它18个引物无多态性指纹     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

瓢虫干标本基因组DNA的提取及RAPD分析

实验对保存多年的瓢虫干标本进行了基因组 ＤＮＡ提取和 ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增。结果显示 ＤＮＡ分子的提取与保存年代长短无直接关系;ＲＡＰＤ－ＰＣＲ增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,分子量大小约为 １９８４ｂｐ～６３０ｂｐ;不同种瓢虫的 ＤＮＡ用同一引物,扩增片段是多态表现,同一种瓢虫的干标本保存时间虽不同,但扩增产物中均具有相同的ＤＮＡ片段。     

鹿鞭及其伪品随机扩增DNA多态性鉴定方法研究

目的建立鹿鞭及其伪品随机扩增DNA多态性(RAPD)鉴定方法,为鹿鞭的鉴别提供可靠依据.方法采用柱层析法从鹿鞭及其伪品中提取线粒体DNA并进行随机DNA多态性扩增.结果正品鹿鞭(梅花鹿鞭和马鹿鞭)与其常见伪品(牛鞭)线粒体DNA随机扩增产物的电泳图谱有明显区别,条带数量和位置均不同,说明本方法可以有效区分正品鹿鞭与其常见伪品.结论 RAPD技术可为鹿鞭及其伪品的鉴别提供一种简单、有效、可信度高的方法.