赤点石斑鱼促性腺激素及其受体基因的克隆和表达模式分析

鱼类脑垂体分泌的促性腺激素(GtHs)与分布在性腺中的促性腺激素受体(GtHRs)所形成的信号通路,在性腺发育过程中发挥了重要作用.为了解GtH/GtHR信号通路在雌性先熟雌雄同体鱼类性腺发育过程中的作用,本文克隆了赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)GtHsβ亚基(FSHβ和LHβ)及其受体GtHRs(Fshr和Lhcgr)基因的序列,并分析了它们在性腺发育过程中的表达模式.结果表明:FSHβ和LHβ具有糖蛋白激素家族成员保守的结构特征;Fshr和Lhcgr具有糖蛋白激素受体亚家族保守的结构特征;FSHβ和LHβ基因仅在脑垂体表达,而Fshr和Lhcgr基因仅在性腺表达;在性逆转早期(ET)阶段FSHβ表达量处于低水平,但在性逆转后期(LT)阶段和雄性阶段表达量升高;LHβ的表达模式与FSHβ相似,但从ET阶段到LT阶段,与FSHβ相比其表达量的升高幅度较低;性腺中Fshr和Lhcgr在雌性和ET阶段表达量都很低,LT阶段明显上升,雄性阶段达到最高水平,但Fshr表达量远远高于Lhcgr.研究结果提示,GtH/GtHR通路参与了赤点石斑鱼的性腺发育过程,其中FSH信号通路在这过程中可能发挥更主要的作用.     

LHβmRNA在文昌鱼脑和哈氏窝的定位及其表达

为确定存在干脑和哈氏窝的脊椎动物促进性腺激素样物质是由自身合成的还是有其他来源,用地高辛标记的黄体素β亚单位核糖核酸（LHβmRNA）探针对文昌鱼脑和哈氏窝进行原位杂交组织化学研究,结果发现LHβmRNA能够在文昌鱼脑的神经细胞和哈氏窝上皮细胞表达,这在分子水平上为哈氏窝与脊椎动物垂体同源以及为促性腺激素功能的演化提供了新证据。     

黄鳝性腺发育过程中Amh和SOX9基因的表达分析

文章研究了黄鳝性腺发育过程中抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh)基因和Sry相关高泳动类非组蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9,SOX9)2个基因的表达量变化及关系,进而推断其基因表达通路,为研究黄鳝性逆转过程中基因的调控理论奠定基础。文章提取黄鳝Ⅰ龄卵巢(Ⅱ期卵巢)、Ⅲ龄卵巢、Ⅱ龄间期性腺早期、Ⅱ龄间期性腺后期、Ⅲ龄精巢5个时期的性腺组织RNA并反转录成cDNA,通过半定量和荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对其表达量进行定量分析。结果表明,Amh和SOX9基因在黄鳝性腺发育过程中的表达没有特异性,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。Amh基因在Ⅲ龄精巢表达有显著增高,SOX9基因的表达量高于Amh(Ⅲ龄精巢例外)。Amh和SOX9基因的表达呈现正相关,后期Amh基因的表达量显著升高可能是由于存在一个诱导SOX9基因表达的信号,两者在黄鳝性逆转过程及精巢的发育过程中存在一定的协同关系,可能存在Amh—SOX9基因信号通路。     

鱼类促性腺激素研究进展

在脑-垂体-性腺轴中,促性腺激素（Gonadotropic hormone ,GtH）是一种重要的激素,对鱼类性腺的发育和成熟以及生殖细胞的发生、发育、成熟及排放都有重要的调节作用,新近的研究还表明,GtH可能对鱼类性别分化产生影响.本文综述了鱼类具有两种GtH和两种GtH细胞以及GtH的功能及其分泌调控等方面的研究进展.     

团头鲂脑垂体GTH细胞钙调素免疫电镜定位

本文运用免疫胶体金电镜定位技术对团头鲂(Megalobrama Ambly cephala)(?)垂体(?)性腺激素细胞进行了钙素(CaM)的超微结构定位。钙调素分别标记在与激素蛋白合成及分泌有关的细胞核、粗面内质网和分泌颗粒中,表明 CaM 参与激素的合成和转运作用。此外,促性腺激素分泌细胞中的大颗粒和小颗粒上均有 CaM,说明这两种颗粒具有共性,均参与激素的分泌活动,这一结果进一步弄清了大、小颗粒的性质,为鱼类的生殖生理及人工催产机理的研究提供了有价值的资料。     

尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica)性腺发育过程的研究

本文研究尼罗罗非鱼性腺发育从孵出至精卵成熟,经过五期(Ⅰ—Ⅴ)。在水温27—30℃下需时110余日始排卵、排精。排卵、排精后的卵巢和精巢为Ⅲ期。卵巢内含空滤泡、2时相和3时相的卵母细胞。     

cGnRH-II基因在性成熟高白鲑不同组织中的定量分析

以性成熟高白鲑的促性腺激素释放激素作为主要研究基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析cGnRH-II基因mRNA在不同器官组织中的表达。结果表明:cGnRH-II基因在各个组织中均有不同程度的表达;统计学分析结果表明,此基因在鱼脑、心脏和卵巢中有较高表达,分别为肌肉组织中的317.86倍、122.79倍和71.01倍。本研究测定了高白鲑cGnRH-II基因mRNA表达水平的相对含量,为进一步了解GnRH直接或间接参与高白鲑性腺发育成熟调节提供理论依据。     

家鸡TSHβ、FSHβ和LHβ重组蛋白表达及纯化研究

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索到高效重组表达pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ的IPTG诱导浓度分别为:200μM、25μM和15μM.并在此基础上利用镍离子亲和层析蛋白纯化技术对重组蛋白进行了纯化.     

LHβmRNA在文昌鱼脑和哈氏窝的定位及其表达

为确定存在于脑和哈氏窝的脊椎动物促性腺激素样物质是由自身合成的还是有其他来源,用地高辛标记的促黄体素β亚单位核糖核酸(LH_βRNA)探针对文昌鱼脑和哈氏窝进行原位杂交组织化学研究.结果发现LH_βmRNA能够在文昌鱼脑的神经细胞和哈氏窝上皮细胞表达,这在分子水平上为哈氏窝与脊椎动物脑垂体同源以及为促性腺激素功能的演化提供了新证据.     

高活性鱼类催产合剂的研究和应用

中山大学生物系鱼类学研究室林浩然教授和加拿大学者合作研究,发现鱼类促性腺激素(GtH)的合成和分泌活动受到下丘脑神经分泌的双重调节,使用多巴胺的拮抗物、排除剂或合成抑制剂都能抑制多巴胺的作用而显著增强促性腺激素释放激素促使促性腺激素分泌和诱导排卵的作用.     

史氏鲟（Acipenser schrenckii）两种促性腺激素β亚基的原核表达

 采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET－22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&;Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）并诱导表达2个基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白相对分子质量分别为：GtHⅠβ亚基大约14 000,GtHⅡβ亚基15 000左右。分别用抗6个组氨酸融合标签的单克隆抗体及兔抗鲟鱼GTH多克隆抗体对2个表达蛋白进行Western Blot分析,结果显示重组蛋白表达正确且有较高的免疫活性。GTHⅠβ重组蛋白在2 h就有明显的表达,6 h后随着时间增加表达量不再增加;25 ℃诱导重组蛋白产量比37 ℃诱导产量低。获得的重组蛋白质将可用于建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。     

黄姑鱼(Nibea albiflora)gsdf基因的克隆及表达分析

为探索gsdf(gonadal soma derived factor)基因对黄姑鱼性别分化和性腺发育的作用,克隆了黄姑鱼gsdf基因ORF序列全长,并运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了该基因在黄姑鱼不同组织和不同发育时期性腺中的表达情况。结果显示:黄姑鱼gsdf基因开放阅读框长648 bp,可编码215个氨基酸,含有TGF-β超家族的保守功能结构域;组织表达分析结果显示,黄姑鱼gsdf基因主要集中在精巢中表达;在23℃左右水温下,孵化后40 d的遗传雄性鱼苗性腺中开始检测到gsdf基因有明显表达(此时组织学上尚看不出精巢形态),49 d后表达量迅速升高,孵化120 d后(精巢分化完成)表达量达到高峰,随后表达量开始下降,直到黄姑鱼精巢成熟之后呈现稳定表达。上述结果提示,黄姑鱼gsdf基因与黄姑鱼性别决定和分化发育过程密切相关。     

大鳞副泥鳅性腺发生和分化的组织学研究

通过人工繁殖技术获得大鳞副泥鳅幼体,采用石蜡显微切片技术对幼体性腺发生、分化的组织学特征进行了系统观察.结果表明大鳞副泥鳅是在出膜后14 d出现了未分化性腺,卵巢分化始于25日龄,到45日龄分化完全;精巢则是分化于30日龄,于75日龄分化为I期精巢.卵巢分化早于精巢.从性腺分化开始,将要发育为卵巢的性腺还表现为体积快速增大,向体腔中间靠拢,横截面变宽,而将要发育为精巢的性腺则呈两端尖中间稍突的梭形,增生并不明显,这些特征可能与雌雄性腺的发育和生殖细胞的分化速度有关,可以作为大鳞副泥鳅性腺早期分化的形态特征.     

尼罗罗非鱼雌性性腺关键LncRNA的鉴定和表达分析

生殖细胞的分化与发育是硬骨鱼类性别分化的重要环节,并受到遗传和环境2个因素的影响.为研究LncRNA在硬骨鱼类卵母细胞发育以及性别分化中的作用,课题组通过转录组测序获得了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)雌、雄性腺中呈现差异表达的LncRNA,并选取LncRNA(TCONS_02477925)开展研究.发现该LncRNA具有2个外显子,属于典型的基因间LncRNA(Intergenic LncRNA),转录本全长1 537 nt,基因组定位于19号连锁群(Linkage Group 19,LG19)上,并且该基因在卵巢的表达水平显著高于精巢.荧光原位杂交结果表明,该LncRNA主要表达在I和II时相的卵母细胞的细胞质中.转录组测序结果及生物信息学分析发现,qrsl1和rtn4ip1可能是该LncRNA的cis靶基因,并且2个靶基因在卵巢中表达丰度较高.因此,本研究表明该LncRNA在罗非鱼卵母细胞发育和性别分化中可能有重要的作用.     

斑马鱼母源凝集素基因zfol的克隆和表达分析

为验证凝集素Zfol是否为母源蛋白及其具体表达模式,揭示凝集素这类来源于母体的免疫物质在鱼类胚胎发育早期的免疫保护作用并提供理论依据,克隆Zfol的基因全长进行了生物信息学分析.利用RT-PCR和Western blot分析了zfol mRNA和Zfol蛋白的时空表达.结果表明:zfol mRNA及Zfol蛋白在斑马鱼胚胎发育过程中的表达均呈动态变化.zfol mRNA在成鱼的卵巢、心脏、肝脏、肾脏、脑中表达,在精巢中未检测到表达.Zfol蛋白在精巢、心脏、脑、肝脏等组织中检测不到表达,而在肾脏中有低含量表达,在卵巢中有高含量表达.     

促性腺激素处理对性未成熟小鼠子宫中STAT3表达和激活的影响

信号转导和转录激活因子3（STAT3）在动物的早期胚胎发生、细胞生长、凋亡控制和细胞运动等过程中起着很重要的作用。以小鼠为材料,利用原位杂交和免疫组化等方法,研究了促性腺激素对性未成熟小鼠子宫中STAT3表达和激活的调节。用PMSG处理性未成熟的小鼠,可刺激子宫腔上皮和腺上皮中STAT3的表达上调、发生酪氨酸磷酸化和核转位而激活。hCG单独处理也能导致STAT3表达的上升和酪氨酸磷酸化的发生,但反应较慢。PMSG处理48h后再以hCG处理24h内能促进子宫腔上皮、腺上皮、基质和肌层细胞中STAT3的表达和激活。研究表明,促性腺激素处理能够上调小鼠子宫中STAT3的表达和激活,促性腺激素处理后小鼠子宫的增殖可能与Jaks-STAT3通路的激活有关。     

小鼠腔前卵泡无血清体外培养的研究

目的:探索添加物维生素C和促性腺激素对小鼠腔前卵泡卵母细胞体外生长发育的影响及适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系.方法:通过改良的TCM199无血清培养系统,在96孔细胞培养板中,每孔放入1个腔前卵泡等条件下体外培养腔前卵泡卵母细胞.结果:随着培养时间的延长,各组卵泡和卵母细胞的直径都不同程度的有所增长,其中FSH400+LH200组和VC50+FSH400+LH200影响均大于VC50和对照组,存在显著性差异(P0.05),但二者之间无显著性差异.FSH400+LH200质量浓度组卵泡存活率、发生GVBD率和第一极体排出率均最高,分别为68.6%、17.6%、9.8%.但VC50+FSH400+LH 200组卵泡成腔率最高,为48%.结论:在改良的TCM199无血清培养系统中,联合添加促性腺激素和抗氧化剂后,卵泡成腔率大有提高,卵泡存活率、发生GVBD率和第一极体排出率仅次于单独添加促性腺激素组.     

PMSG的生物学特性及在生命科学研究领域中的应用

PMSG也称为eCG是从妊娠母马血清中分离纯化的促性腺激素,具有LH和FSH两种活性。自1930年问世以来,其提取工艺和产品纯度在不断地提高。由于PMSG在动物体内的半衰期较长,同一分子又具有FSH和LH的双重活性,在动物繁殖生产中具有广泛的用途,近年来在生命科学的研究领域中同样发挥了重要作用。     

中华乌塘鳢血清性类固醇激素含量与性腺发育的关系及其季节变化

采用放射免疫法(RIA)测定了中华乌塘鳢(Bostrichthys sinensis)不同性腺发育期血清雌二醇(E2)、孕酮(P)和睾酮(T)的含量,并分析了其季节变化.结果表明,在雌鱼性腺发育过程中,Ⅱ期卵巢个体血清E2的含量最低,Ⅲ期卵巢个体E2的含量开始上升,Ⅳ期卵巢个体E2的含量达到高峰,Ⅴ期卵巢个体E2的含量极显著(p<0.01)下降.在雄鱼性腺发育过程中,Ⅱ期和Ⅲ期精巢个体血清E2的含量都比较低,Ⅳ期精巢个体E2的含量最高,Ⅴ期精巢个体E2的含量下降.雌鱼和雄鱼血清P和T的含量随性腺发育而上升,Ⅴ期卵巢和Ⅴ期精巢个体P和T的含量均达到峰值.雌鱼和雄鱼血清E2、P和T的含量均具有明显的季节变化,其高低均依次为6月>10月>3月>1月.     

大鼠胚胎性腺异体异位埋植的研究

为探讨胚胎性腺(睾丸与卵巢)异体异位埋植后的生长发育和内分泌功能,将大鼠胚胎睾丸和卵巢分别移入摘除性腺的成年雄性和雌性大鼠颈部皮下和肾被膜下.埋植后分不同时间取出埋植物,常规染色观察埋植物在异体异位的生长发育.细胞化学和免疫组织化学法观察埋植物的功能状态.放射免疫法测定血清性激素浓度.结果显示埋植的胚胎性腺在异体可生长发育至成年状,3-β羟甾脱氢酶、性激素与性激素受体在睾丸与卵巢的内分泌细胞中呈阳性反应,血清促性腺激素和性激素在埋植后均有明显增加.由此证明胚胎性腺埋植到异体成年大鼠体内后可正常发育并具内分泌功能.