3-酮基嘌呤还原酶(TSC10)表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的：Tsc10基因所编码的3-酮基嘌呤还原酶是酵母中神经酰胺合成的重要因子,本文研究从酵母中提取神经酰胺经济、便捷、高效的方法。方法：1.利用构建含有tsc10基因的毕赤酵母GS115表达载体pPIC3.5K-tsc10。2.电转化法将该表达质粒转化到GS115感受态细胞中。3.用G418筛选以及PCR鉴定。4.使用qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测。结果：经过G418筛选以及PCR鉴定后确定获得了包含tsc10基因的毕赤酵母转化子,经过qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测后发现tsc10基因在20个阳性菌株中均可以稳定、高效表达。结论：本方法成功构建了3-酮基嘌呤还原酶高表达的毕赤酵母菌株,并为后续获得高收率神经酰胺奠定了基础。     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

类人胶原蛋白表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

基于人胶原蛋白胶原域序列特征,设计合成了一段类人胶原蛋白基因单体gel.采用同向串联方式,构建了含6个单体的类人胶原蛋白表达载体pPIC9KG6,并经DNA测序鉴定.将pPIC9KG6电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)经G418筛选得到多拷贝转化子,通过甲醇诱导表达类人胶原蛋白,SDS-PAGE检测表明:初步表达的类人胶原蛋白为胞外产物,其表观分子量为112 ku.     

小麦内质网氧化还原酶在毕赤酵母中的表达

为开发健康天然的新型酶制剂型面粉改良剂,利用毕赤酵母重组表达了小麦内质网氧化还原酶1(wEro1);将wero1基因亚克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα A,实现了wEro1在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的分泌表达,优化诱导表达条件后wEro1的产量可达(53.24±2.11) U/mL;应用硫酸铵沉淀和阴离子交换层析纯化了wEro1,对电泳纯wEro1进行酶学性质研究.结果表明:wEro1具有催化二硫键异构酶(PDI)的巯基氧化活性,且最适pH为7.5,最适温度为30℃;在低温和中性pH条件下,该酶具有较好的稳定性.将毕赤酵母重组wEro1添加到面粉中,考察其对面粉加工品质的影响,发现毕赤酵母重组wEro1改善面粉粉质特性的能力比大肠杆菌重组wEro1更强.     

人整合素β3亚基毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

目前研究表明整合素岛亚基是多种病毒的细胞表面受体,然而整合素岛亚基与不同病毒受体结合蛋白VAP相互作用的分子机制还不完全清楚。为此,设计引物,采用RT-PCR方法扩增人岛亚基包膜外区约2．1kb片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3．5K中。双酶切鉴定挑取阳性克隆pPIC3．5Kβ3,测序证实目的基因序列正确。将pPIC3．5K-β3,转化毕赤酵母X-程菌GS115,在浓度为3．0mg／mL的G418选择培养基上,筛选出含有多拷贝目的基因的阳性菌株,PCR可扩增出约2．1kb的目的条带。阳性菌株经1％甲醇诱导表达,Western—blot可在酵母菌体中检测到约80kDa的目的蛋白条带。上述结果表明,成功构建了人整合素角亚基毕赤酵母表达载体,筛选获得多拷贝阳性菌株并成功表达,为进一步研究人整合素岛在病毒感染中的作用及其单克隆抗体的制备奠定基础。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。     

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg~(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg~(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg~(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

天蚕抗菌肽B基因在毕赤酵母中多拷贝表达载体的构建

根据Bgl Ⅱ和BamHⅠ同尾酶的特点,通过对pPIC9K／CB进行改造,获得了不含BamHⅠ位点的CecropinB表达框,并在此基础上构建了含三拷贝CecropinB表达框的毕赤酵母表达载体,为CecropinB的进一步开发与应用打下了基础。     

RGD-拖丝蛋白基因的构建及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据天然拖丝蛋白的高度重复性序列,引入与细胞黏附有关的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列,以毕赤酵母偏好的密码子化学合成RGD-拖丝蛋白基因单体,通过"头尾相连"的多聚化策略,倍加成16聚体与32聚体基因.分别将这两种多聚体与分泌型表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,用G418筛选毕赤酵母重组菌.通过甲醇诱导表达,培养液上清的SDS-PAGE分析表明RGD-重组拖丝蛋白获得分泌型表达.     

BMP4重组蛋白在毕赤酵母中表达载体构建与纯化分析

以骨形态发生蛋白(BMP4)为研究对象,将BMP4基因与IgG-Fc基因结合,改造成为BM P4-Fc融合蛋白,经巴斯德毕赤酵母诱导表达和DEA E阴离子纯化获得目的蛋白,并利用间充质干细胞验证了其生理活性.结果表明:使用巴斯德毕赤酵母能够很好表达B M P4-Fc融合蛋白,通过提纯条件,成功分离纯化BM P4-Fc融...     

小鼠白细胞介素-10表达载体的构建及其在N9细胞中的表达

白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)是免疫系统最重要的抗炎症细胞因子之一,具有神经保护作用。为了探究IL-10发挥神经免疫的抗炎作用,该文首先采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从小鼠脾脏组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA;再以腺相关病毒(AAV)为载体,构建了带有高亮度增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体AAV-IL10-EGFP,观察了其在小胶质细胞系N9细胞中的表达状况;最后采用实时荧光定量(QT-PCR)的方法,检测AAV-IL10-EGFP在N9细胞中的抗炎作用。     

α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达

为避免α-葡聚糖造成的制糖过程中的糖分损失、制炼难度增加以及糖产品质量下降,利用α-葡聚糖酶分解而直接去除α-葡聚糖是目前最佳的选择.文中扩增了α-葡聚糖酶基因dex,构建组成型表达载体pGAPZαA-dex;以毕赤酵母KM71H为受体菌,将表达载体整合进入受体菌基因组,构建了组成型表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌.摇瓶发酵120h,α-葡聚糖酶酶活达到60.4U/mL,从而实现了α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达,使发酵过程无需使用甲醇进行诱导,提高了生产和使用安全性.     

重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达

目的：在巴期德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽，方法：用SacI和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒，电打孔法导入毕赤酵母GS115后，在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子，然后根据甲醇利用快速型（Mut^ ）和甲醇利用缓慢型(Mut^s）菌株的不同生长特点，筛选出Mut^ 和Mut^s型转化子，用PCR法进一步鉴定阳性克隆，分别用甲醇诱导Mut^ 和Mut^s型转化子表达目的蛋白4d，取培养产物冻干浓缩，进行SDS-PAGE和Western blotting，筛选出能特异表达目的的蛋白的菌株，分析蛋白的含量及纯度。结果：重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达，其表达量约占培养上清分泌蛋白的76.5%，结论：重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达。     

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.     

蛇神经毒素在毕赤酵母中的分泌表达及其分离纯化

文中主要研究了毕赤酵母基因工程菌的构建及其发酵表达产物蛇神经毒素的分离纯化条件。蛇神经毒素编码基因由本实验室设计、合成，并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His-Mut+)，筛选His+Muts型菌株，经诱导表达，产物进行SDS- PAGE电泳鉴定，相对分子质量与理论值一致，目标蛋白经小试发酵产量可达350mg/L。利用超滤、离子交换树脂及分子筛分离纯化，产物经高效液相色谱(HPLC)分析纯度达92%。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

单链莫奈林基因表达载体的构建及其分泌表达

根据甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，选择酵母偏爱密码子，化学合成单链莫奈林(Single-Chain Monellin，SCM)基因片段，并拼接成全基因．基因的DNA序列分析表明，合成的单链莫奈林基因与设计的一致．该基因插入于毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中置于AOXI启动子的控制下，并通过电转化技术将重组质粒pPIC9K／SCM导入Pichia pastoris，在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子．转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，用SDS-PAGE检测发酵液，表明SCM的分泌表达蛋白可达发酵液蛋白含量的90％．     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.