一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法

依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.     

一种简便快速筛选重组子的方法

将转化后的单菌落置于快检缓冲液中,振荡后,直接通过琼脂糖凝胶电泳比较质粒大小,2h内可筛选出重组子．详细介绍了快检缓冲液配方、快检效果、注意事项以及与其它方法的优势比较．     

结合PCR扩增快速筛选鉴定重组质粒

针对如何方便快捷筛选鉴定阳性克隆（重组质粒），本在实验室研究的基础上，创建了一种结合聚合酶链式反应简便快筛选鉴定阳性克隆的方法，用和Triton裂解液裂解菌落，离心后上清作为模板，再用特异引物进行PCR扩增，2h就可以得出结果，本方法具有节约省时，重复性好，结果直观，准确等优点，这为从事分子生物学研究的实验室快速筛选阳性克隆提供了方便。     

长片断引物反向PCR方法构建重复序列的重组质粒

构建重复序列的重组质粒比较困难,因为扩增重复序列会产生多聚物.利用长片断引物反向PCR方法构建重组质粒pET20b-C1-Xyn-C1,将碳水化合物结合模块C1连接在木聚糖酶Xyn两端,为类似质粒的构建提供新方法.第一步,以C1特异性正向引物LF、载体特异性反向引物VRP从pET20b-Xyn-C1模板上扩增C1-pET20b长片断DNA,作为第二步的正向引物;第二步,以pET20b-C1-Xyn为模板,Xyn特异性反向引物RX,正向引物与模板上pET20b同源区域匹配,阻止了模板上C1同源区域的匹配,从而抑制多聚物产生;反向PCR扩增得到线性重组质粒C1-pET20b-C1-Xyn,将此线性产物用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,得到含重复序列的pET20bC1-Xyn-C1转化子.     

两种消除Klebsiella pneumoniae重组型质粒的方法

对于工业发酵菌种肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),研究发现有两种消除其重组型质粒的有效方法,一种是连续传代培养,另一种是使用消除剂十二烷基硫酸钠(SDS)。对K.pneumoniae重组菌连续20代传代培养后,发现其质粒具有较高的消除率;而以0.2%SDS复合Ca2+处理K.pneumoniae重组菌,也能有效消除其重组型质粒,且该方法省却了反复的传代培养,能快速得到质粒消除菌,更具简便易操作性。消除了质粒的K.pneumoniae能再次接纳新的质粒,有效避免了因质粒不相容性带来的转化不成功,进而可用作宿主菌积累更多的生理性状。     

产 PHB 重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

从工程应用的角度研究了重组Ｅ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８Ｕ－ＰＨＢ）的质粒稳定性，结果表明，质粒ｐＴＺ１８Ｕ－ＰＨＢ具有结构稳定性和分裂不稳定性，ＰＨＢ在胞内的大量积累和重组菌较低的生长速率增加了质粒的分裂不稳定性。为了保证细胞的正常生长及表达，在种子培养基中必须添加氨苄青霉素（Ａｐ）；由于接种时种子带入的１０ｍｇ／ＬＡｐ足以杀死丢失了质粒的细胞，因而在摇瓶发酵阶段不必再添加Ａｐ。在ＬＢ和ＬＢＧ培养基中传代１８次后，带质粒的菌分别为７．４％和３．５％；细胞每分裂一次，质粒的平均丢失率分别为０．９６％和０．９３％。并建立了野生菌的Ａｐ敏感动力学方程和质粒丢失的动力学方程     

大肠杆菌质粒DNA不同提取方法的比较

实验采用简化的碱法少量提取法、简便快速的煮沸法及试剂盒法提取质粒 p CB30 2 -3.并通过一对特异引物对质粒 DNA进行 PCR(聚合酶链式反应 )扩增 ,分别对各种方法所提取的质粒 DNA及其 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果表明碱法少量提取法和试剂盒法所提取的质粒 DNA纯度和产量高 ,且重复性好 ,达到了分子生物学实验要求 .其中简化的碱法少量提取法具有结果稳定和经济的特点 ,非常适合大多数实验室使用 .     

一种简便快捷的植物线粒体质粒DNA的提取方法

介绍了一种从植物材料中提取线粒体质粒DNA的方法,该方法不需要密度梯度离心和有机溶剂油提,整个提取过程可在较短时间内完成,该方法简便,快捷,效果好,对拷贝数低的线粒体质粒DNA得率高。     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

氧化硫硫杆菌重组质粒pSDT125的构建及其在大肠杆菌之间的转移

对氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)隐蔽性质粒pTt12进行了限制性酶切分析,并绘出了限制性酶切图谱,其大小为13.7Kb.将pTt12质粒与pBR325质粒重组,得到了重组质粒pSDT125(Cm',Ap',Tc~s).氧化硫硫杆菌重组质粒pSDT125本身不具有接合转移能力,但它在广泛寄主范围的转移性质粒RP4的带动下以较高的频率在大肠杆菌(Escherichia coli)之间转移,表明在氧化硫硫杆菌质粒pTt12上存在着与接合转移有关的DNA序列.     

体外快速筛选抗HIV药物的一种新方法

目的:介绍一种体外快速筛选抗H IV药物的新方法。方法:采用荧光染料钙荧光素(Cal-ce in-AM)标记H IV感染的慢性H9细胞(H9/H IV-1ⅢB)与不同稀释浓度的药物作用后,与靶细胞MT-2细胞混合培养,2 h后用荧光显微镜观察MT-2和H9/H IV-1ⅢB融合细胞的变化;孵育3 d后用MTT法检测药物对H IV感染细胞的保护作用和H IV-1p24抗原试剂盒检测药物作用后的细胞培养上清p24抗原含量的变化。结果:药物(双黄连粉针剂)能够抑制MT-2和H9/H IV-1ⅢB细胞融合(双黄连粉针剂抑制融合的EC50为3.18 mg/L,选择指数SI大于314.5);能够保护H IV感染细胞的死亡(EC50为10.59 mg/L,SI大于94.43)和减少H IV-1p24抗原的表达(EC50为23.29 mg/L,SI大于42.9)。结论:运用此方法4~6 h即可初步判断药物是否具有抗H IV的作用,此方法可简便直观,敏感快速进行抗H IV药物的筛选。     

一种高可靠性的头部校验夜间行人快速识别方案

针对夜间行人检测成像尺度不一等因素所引起的类内方差较大、实时性不足等问题,本文在统计学习的应用原理下,设计了基于熵加权和FCSVM优化的头部校验夜间行人快速识别方案.该方案应用熵加权原理改进梯度直方图特征,引入了三分支结构的支持向量机对目标进一步识别,同时利用快速分类支持向量机(FCSVM)降低运算所需的开销,确保实时性,最后通过头部校验方法对误检目标进一步分析评估,进一步提高图像匹配的准确度.实验结果表明,该方案在夜间环境下能有效区分远红外行人目标,在充分确保行人实时性的基础上,在市区、郊区等不同应用环境中,均具有良好的实用性.     

一种适用于批量筛选和鉴定拟南芥突变体的快速DNA提取方法

DNA提取是拟南芥突变体筛选与鉴定中的关键环节.结合拟南芥突变体鉴定特点和DNA提取特点,对传统SDS法进行改良,摸索出一种简易、快速且经济的DNA提取方法,并将其应用到突变体的批量筛选与鉴定中.使用该方法可在常温下利用10mg左右拟南芥叶片,以少量试剂,通过简单的研磨、离心、沉降和干燥等步骤便能快速制备用于PCR检测的DNA模板.采用本方法个人提取单个样品DNA仅需15min左右,每小时可提取48个DNA样品.研究采用该方法提取了一批待鉴定拟南芥突变体的DNA样品,利用三引物法对其进行PCR检测,结果表明DNA样品浓度高,DNA扩增成功率高达100%,且目的条带清晰,说明该方法在拟南芥突变体的筛选和鉴定上是适用且高效的,可广泛应用于实验室突变体库的建立.     

一种快速筛查和确定保健品中11种降糖类药物的检测方法

采用高效液相色谱一离子阱飞行时间串联高分辨质谱对于保健品中降糖类药物共11种成分进行快速筛查、定性识别和准确定量。样品经含甲醇溶液超声提取,提取液经OuEChERS吸附剂净化,以C18色谱柱（150mm×2．0mm,3．0μm）分离,5mmol／I。乙酸铵溶液和0．5％甲酸乙腈为流动相梯度洗脱,正离子模式扫描。结果表明,11种化合物在2～1000μg／L范围内呈良好的线性相关性,相关系数均大于0．991。保健品样品中各化合物的定量限（以信噪比≥10计）分别为2．0～5％g／kg。在低、中、高3个添加水平下,各化合物的平均回收率为72．3％～118．1％,相对标准偏差（RSD）为0．5％～8．4％。该方法利用精确质量数匹配和自建标准谱库检索,实现快速筛查,并使用多级特征碎片离子进行确证,具有简便、快速、高效、准确等优点,适用于保健食品中降压降糖类药物的快速筛查和测定。     

An easy-to-use site-directed mutagenesis method with a designed restriction site for convenient and reliable mutant screening

Site-directed mutagenesis (SDM) has been a very important method to probe the function-structure relationship of proteins. In this study, we introduced an easy-to-use, polymerase chain reaction (PCR)-based SDM method for double-stranded plasmid DNA, with a designed restriction site to ensure simple and efficient mutant screening. The DNA sequence to be mutated was first translated into amino acid sequence and then the amino acid sequence was reversely translated into DNA sequence with degenerate codons, resulting in a large number of sequences with silent mutations, which contained various restriction endonuclease (RE) sites. Certain mutated sequence with an appropriate RE site was selected as the target DNA sequence for designing a pair of mutation primers to amplify the full-length plasmid via inverse PCR. The amplified product was 5′-phosphorylated, circularized, and transformed into an Escherichia coli host. The transformants were screened by digesting with the designed RE. This protocol uses only one pair of primers and only one PCR is conducted, without the need for hybridization with hazardous isotope for mutant screening or subcloning step.     

胸腺素α原基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

胸腺素α原(ProTα)作为一种免疫增强剂,对各种免疫缺陷疾病、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用.此外ProTα可以作为核蛋白参与细胞增殖,在肿瘤的预测、诊断及治疗中有一定应用.根据人胸腺素α原已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(P1/P2),应用RT-PCR法从中国人外周血中克隆到ProTα基因,将扩增产物连接到pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组质粒进行序列测定;同时用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物,将该基因片断插入经同样双酶切的质粒pGEX 6P-1中,转化大肠杆菌BL21中进行表达.结果表明,克隆到的ProTα基因与参考的氨基酸同源性为99.70%;原核表达产物经过SDS-PAGE电泳分析,融合蛋白分子量为37 ku,主要以可溶形式存在.     

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化.根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因.合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化.成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和western-h1ot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶.获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础.     

电子设备退化分析的新方法

偏压浸透模型是基于对实际薄膜设备退化的分析而提出的,研究的是类似于薄膜退化过程的导体向绝缘体或半导体的转化过程,并对标准浸透模型和偏压浸透模型做一对比,进一步说明偏压浸透模型更适合于分析实际薄膜的退化.