小菜蛾颗粒体病毒DNA限制性酶切分析及基因组DNA片段克隆

小菜蛾颗粒体病毒ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ酶切，经０．７５％琼脂糖凝胶电泳，分别得到１２条带和８条带，平均分子量为１１３．０ｋｂ。用Ｓｕｐｅｒｃｏｓ１ Ｃｏｓｍｉｄ作载体，将Ｓａｕ３ＡＩ部分消化的ＰｘＧＶ－ＤＮＡ随机片段插入该载体的ＢａｍＨＩ酶切位点，转化于ＸＬ１－Ｂｌｕｅ受体菌，经Ａｍｐ平板筛选转子，挑出２５６个Ａｍｐ＾＋菌落，以＾３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记的ＰｘＧＶ－ＤＡＮ为探针，斑点杂交筛选得到     

木麻黄小板基因组DNA的快速提取研究

提取介质中加入２．５％β－巯基乙，能有效却除次生物质对林黄基因组ＤＮＡ提取的影响。用新方法所提ＤＮＡ产率比用前人方法提出的高出０．８倍左右，鉴定２结果表明：鲜小枝、干小枝的ＤＮＡ样品皆为４８ｋｂ左右，适于限制性酶切和ＲＡＰＤ反应；同时发现同一株树的鲜小板、干小枝，基因组ＤＮＡ ＲＡＰＤ扩增可得到相同的产物。     

猪2型圆环病毒福建析的全基因组克隆与序列分析

根据已发表猪2型圆环病毒PCV2序列设计两对特异性扩增引物对福建龙岩市某规模化猪场疑似PCV2感染病例进行PCV2的检测与全基因组克隆,经测序与序列拼接,获得了PCV2福建株全基因组序列PCV2-LY.序列分析结果表明,PCV2-LY全长1767 bp,与国内外各分离株同源性在95.1 %-98.0%之间,ORF1氨基酸同源性在97.1%-99.6%之间,而ORF2氨基酸同源性在92.7%-99.1%之间     

木麻黄小枝基因组DNA的快速提取研究

提取介质中加入2.5% β-巯基乙醇, 能有效去除次生物质对木麻黄基因组DNA提取的影响.用新建方法所提DNA产率比用前人方法提的高出0.8倍左右.鉴定结果表明:鲜小枝、干小枝的DNA样品皆为48kb左右,适于限制性酶切和RAPD反应; 同时发现同一株树的鲜小枝、干小枝,基因组DNA RAPD扩增可得到相同的产物.     

克隆含有MT—I和MT—Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ作为探针，从１２９小鼠的基因组库中获得含ＭＴ－Ⅰ基因的ＤＮＡ片段。从６．８＊１０＾５的噬菌斑中挑出４个阳性噬菌体克隆，分别命名为１－１，２－２，１－６和４－３。     

栽培高粱叶绿体DNA的酶切片段分析

实验选取了具优良性状的高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）４品种、两细胞雄性不育系,采用改进的高盐低ＰＨ值法对其叶绿体ＤＮＡ进行提取,纯化、限制性内切酶酶切分析。结果表明,改进的高盐低ＰＨ值法无论在ＤＮＡ的得主及质量上都有一定的提高,足以满足ＲＦＬＰ或其他酶切方法的需要;高粱栽培品种间的叶绿体ＤＮＡ变异很少,反映了各族间极其相近的亲缘关系,在可育胞质品种与胞雄性不育系的叶绿体ＤＮＡ之间明显存在两类     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源DNA片段的克隆

利用作者克隆的酿酒酵母基因启动子片段Ｙ８为探针和菌落原位杂交方法，从构建的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＮＮ２７基因组文库中共筛选８个阳性克隆。根据这些克隆中插入片段大小和限制酶切结果，可将其划分为６种，分别命名为ＹＮ１－ＹＮ６．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，这６种ＤＮＡ片段不仅能与６．５ｋｂ的全长Ｙ８探针我，而且均能与ＰｓｔＩ酶切Ｙ８所得的３段ＤＮＡ探针杂交。     

昆虫全基因组DNA的保存及提取

以蚂蚁、天牛、蝗虫等昆虫为实验材料,建立了75%酒精常温浸泡密封保存和福尔马林常温浸泡密封保存昆虫样品2~4周后进行全基因组DNA提取的方法。基因组DNA经紫外分光光度法(260 nm、280 nm)、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测,结果表明:从两种方法保存的样品中均能提取到纯净完整的基因组DNA,适用于分子生物学实验。     

草鱼线粒体DNA酶切图谱的研究

用１０种限制性内切酶对草鱼肝脏线粒体ＤＮＡ进行了分析，其分子太小约１６．５８ｋｂ．ＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＢｇｌＩ，ＨｉｎｄⅢ，ＢⅡ，ＰｖｕⅡ，ＸｈｏⅠ，ＥｃｏＲⅠ，ＳａｌⅠ在草鱼ｍｔＤＮＡ分子上分别具有２，３，３，４，７，３，６，２，４及０个切点。根据单酶解及双酶解结果建立了草鱼ｍｔＤＮＡ的限制性酶切图谱。     

枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶的克隆与表征

利用已公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中假定的葡聚糖内切酶基因进行引物设计,从菌株Bacillus sp.ECU0013中克隆表达得到重组葡聚糖内切酶BsEG.经镍柱纯化后进行酶学性质表征,其最造反应pH约为6.0;最适反应温度为50℃,具有较好的热稳定性,50℃时半衰期达101h.Km值为20.1 g/L,相应的Vmax...     

四种昆虫病毒基因组DNA限制性内切酶图谱分析

应用限制性内切酶图谱分析,结果ＤＮＡ单分子层和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法,对黄地老虎颗粒体病毒,甘兰菜粉蝶颗粒体病毒,三叶草夜蛾颗粒体病毒和荨麻蛱蝶核型多角体病毒等四种杆状病毒提取基因组ＤＮＡ用９处限制性内切酶酶切,得到不同的酶切图谱使其在基因型上进行区分,通过ＤＮＡ单分子展层发现其核酸链都呈闭环和超螺旋构型,用＾３２Ｐ标记ＡｕＮＰＶ与ＧＶ杂交,没有发现与ＧＶ的同源性。     

应用“酶切连接”克隆法构建TALEs

TALEs是在植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonas)上发现的一类天然的DNA结合蛋白,其重复域已经成为模块化构建单元,用于人工DNA结合蛋白的构建。人工TALEs能够用于多种基因工程操作,包括转录调节和基因组编辑。为了在常规分子生物学实验室稳定、经济地构建TALE-TFs和TALENs,本文采用TALE Toolbox试剂盒,运用PCR扩增和"酶切-连接"克隆法构建人工TALEs。结果表明,该构建策略是一种快速高效构建TALEs的方法,能够在1周内完成TALEs构建。     

10种昆虫过氧化氢酶基因的全基因组鉴定与特征预测

【目的】在全基因组水平上鉴定10种具有代表性昆虫的过氧化氢酶(CAT)基因,并对鉴定所得CAT基因的基本特征和系统发育关系分别进行预测和分析。【方法】在NCBI数据库中下载CAT氨基酸序列作为询问序列,通过本地Blast方法在10种昆虫全基因组水平搜索和鉴定CAT基因并命名。通过生物信息学方法预测10种昆虫CAT家族基因的特征、氨基酸同源序列一致率、保守结构域等。通过MEGA-X软件用最大似然法推断10种昆虫的CAT基因的系统发育。【结果】共鉴定得到23个CAT基因,内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)、东亚飞蝗(Locusta migratoria)、人虱(Pediculus humanus)、苜蓿蓟马(Frankliniella occidentalis)、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、家蚕(Bombyx mori)和意大利蜜蜂(Apis mellifera)基因组上分别有3,1,1,1,4,3,2,1,6和1个CAT基因,均具有全长的转录组序列,编码406～553个氨基酸,氨基酸分子量为46.0～63.7kDa,等电点为5.21～9.19。鉴定得到的CAT基因共有122个外显子,99个内含子,且外显子与内含子分布模式在物种间差异较大而种内的CAT基因结构相似。有7个CAT基因编码有信号肽,信号肽包含17～22个氨基酸残基。所有CAT基因编码的氨基酸序列的N端具有1个由17个氨基酸组成的CAT近端活性区域,而C端由9个氨基酸组成的CAT血红素配体区域所组成;其中家蚕的BmCat2基因中单独含有1个细菌胞外溶质结合区域。10种昆虫的CAT1基因具有1∶1的直系同源关系,家蚕出现特异性扩增独立形成支系,与CAT1支系互为姐妹群。【结论】研究结果提供了10个代表性昆虫CAT基因的基础信息,为进一步开展该基因的功能研究奠定了基础。     

高质量水稻基因组文库构建的策略和方法

采用改良的CTAB法提取水稻基因组DNA,经Sau3AI部分酶切的产物经透析袋电洗脱法回收、正丁醇浓缩后,以1∶1的摩尔数比和载体臂连接.包装后测定,文库滴度达到106pfu/ml;随机酶切重组克隆显示,插入片段达到预期的15~23 kb之间,提示该方法适于植物材料高质量基因组文库的构建,有利于分离完整的基因序列及其调控区.     

黄孢平革霉（Phanerochaete chrysosporium）木质素过氧化物酶基因的克隆与分析

用大肠杆菌克隆载体ｐＵＣ１０构建白腐丝状担子真菌黄孢平革霉（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＭＥ４４６基因组文库，用分离自ＢＫＭ－Ｆ１７６７菌株的木质素过氧化物酶ｃＤＮＡ片段ＣＬＧ４和ＣＬＧ５为探针，从构建的基因组文库中分离到一个含木质素过氧化物酶基因的重组子ｐＧＬＧ－Ｍ１。对该重组子插入片段所作的限制酶谱分析结果表明，它与来自ＢＫＭ－Ｆ１７６７的ＧＬＧ２片段的限制酶谱十分相似。     

克隆含有MT-Ⅰ和MT-Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠MT-ⅠcDNA作为探针,从129小鼠的基因组库中获得含MT-Ⅰ基因的DNA片段。从6.8×10⁵的噬菌斑中挑出4个阳性噬菌体克隆,分别命名为1-1, 2-1, 1-6和4-3。在这4个克隆中1-1和2-1的阳性信号更强些。应用插入片段的末端引物作为探针进行杂交结合部分酶切的方法,对这2个克隆的插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,确定了克隆1-1和2-1的酶切图谱及MT-Ⅰ基因在2个克隆DNA中的位置。并进一步发现和证明了在2个克隆中含有MT-Ⅱ基因。