酶体外定向进化(Ⅰ)突变基因文库构建技术及其新进展

介绍在酶体外定向进化研究中,几种常用基因文库构建技术及其应用方面的最新进展．同时介绍近年来．一些新开发的基因文库的构建技术及其应用情况．对目前几种主要方法的特色和缺陷进行讨论．     

酶体外定向进化(Ⅲ)展示技术及其应用

利用展示技术构建的蛋白质／多肽的突变体库，可以通过高通量进行高效地分析和筛选，因此特别适用于改造蛋白质．文中综述噬菌体、细胞表面、核糖体、mRNA等展示技术的原理和方法，以及其在酶定向进化中的应用．     

酶定向进化技术研究进展

酶定向进化是模拟自然进化过程、用于改造酶性质的一种新策略．在以易错PCR为代表的无性进化技术基础之上,有性进化技术的发展使酶定向进化更接近于自然进化过程．与此同时为解决巨大容量的突变文库与有限的筛选技术之间的矛盾,许多新的高通量筛选方法不断涌现,大大加快了酶定向进化技术的发展．文章从构建高质量的突变基因文库和选择有效的高通量筛选方法两方面,详细总结了近几年出现的新技术并对其应用情况进行介绍．     

用体外定向进化的方法对EPSPS合酶基因草苷膦抗性机制的研究

为了寻找EPSP合酶中某些与草苷膦抗性相关的位点,利用体外定向进化技术,对可变盐单胞菌HT7的EPSP合酶基因,荧光假单胞菌G2的EPSP合酶基因以及按植物偏爱密码子合成G2的EPSP合酶基因,进行DNA shuffling,通过EPSP合酶缺陷型菌株E.coil ER2799的功能互补筛选,获得了7个草苷膦抗性有较大变化的EPSP合酶突变体.     

人工酶与定向进化的前沿与挑战

定向进化是在实验室环境中,在分子水平上模拟进化过程,得到具有期望特征的蛋白质的方法,目前已成为蛋白质设计改造的重要方法。定向进化不仅可以用于天然蛋白质的改造,也可以通过改造现有的酶,使其具有新的催化活性,从而构建人工酶。本文重点介绍工业生物催化、纳米酶设计和光催化3个方向的前沿成果,并讨论人工酶与定向进化领域存在的挑战和问题。     

豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究

通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.     

构建突变基因文库的定向进化研究进展

1.介绍定向分子进化是在实验室条件下模拟自然选择过程,改变原有蛋白的氨基酸序列,以期找寻预期性能的突变蛋白。定向分子进化实验的成功与否取决于制备的突变体库的质量和简捷、高效的筛选方法。随着体外定向进化分子改造新策略的不断涌现,以及相关领域如生物信息学、功能基因组学、功能蛋白质组学等的更新和完善,各种基因改组技术的应用正受到足够的重视。其中,酶工程的定向进化已为基因     

肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究

肝素酶 (ＥＣ4 .2 .2 .7)是一类能降解肝素类物质的裂解酶 .自Ｋｏｒｎ等在肝素黄杆菌 (Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｐａｒｉｎｕｍ)中发现了肝素酶以来 ,肝素黄杆菌一直是肝素酶的主要来源 .目前的研究表明 ,肝素黄杆菌中有3种肝素酶 :肝素酶Ｉ[1,2 ] 、肝素酶ＩＩ[3] 和肝素酶ＩＩＩ[4 ] .在它们的共同作用下 ,肝素酶能特异性地断裂肝素链上的特定序列 ,从而产生一系列寡糖片段 .肝素酶具有许多重要的医药用途 ,包括体外循环中肝素的消除[5] ,肝素精确结构的确定[6 ] ,肝素抗凝机理及肝素结构和功能的研究[7,8] ,制备低分子量肝素[9…     

利用EvolvR系统对酶基因实现多窗口定向进化的研究

EvolvR系统是一种CRISPR介导的新型定向进化技术,本研究探索其在酶基因序列定向进化中的适用性以及突变效率,同时在此基础上扩大EvolvR的突变窗口长度.研究成功将4个能高效表达的单个sgRNA串联,并检测到靶向同一基因的3个不同靶位点.证明EvolvR具有在目标基因区域大范围制造突变的潜力,具有很高的应用价值....     

组成型漆酶高产菌株的筛选及其产酶条件研究

通过平板显色法及氧化带测定法初筛,愈创木酚法测定培养液漆酶酶活力复筛,从菌株中获得1株组成型漆酶高产红芝Ganoderma lucidum菌株.对红芝液体培养产酶条件的研究表明:以麦芽糖和硫酸铵为碳、氮源时,更有利于红芝漆酶的分泌,其酶活高于以其他物质作为碳、氮源;在250 mL三角瓶中装50 mL培养基有利于产酶;适宜初始培养基pH为6.0;适宜培养温度为30 ℃.     

应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol.L-1升高至0.63 mmol.L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol.L-1升高至0.77mmol.L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃.     

产菊粉酶丝状真菌菌株的筛选及产酶发酵条件的研究

经初筛和复筛,从菊芋周围土壤中筛选出酶活力较高的1株丝状真菌A24,经进行菌种鉴定,确定为黑曲霉.经单因子试验和多因子的正交试验分析,确定了产酶最高的最适条件为:3%菊芋汁、0.5%牛肉膏、2%(NH4)2HPO4、1?CO3、、初始pH 6.5,摇瓶转速160 r/min,28℃培养96 h,菊粉酶活力最高为30.2 U/ml.     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.     

高产柚苷酶菌株的筛选研究

以桔皮粉为诱导底物,采用富集培养的方式从堆积腐烂桔皮的泥土中筛选出一株高产柚苷酶(Naring-inase)的生产菌株WP-108.其摇瓶发酵培养测定其酶活力达910.1 U/mL,同时其继代培养稳定性良好.通过对菌株的培养特征,形态特征的观察,初步鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger).     

一株产耐高温漆酶真菌的筛选

从安徽省合肥市西郊的大蜀山上采集了40余株木腐真菌,将其在含有α-萘酚的麸皮汁平板上分离纯化后,根据菌落周围产生紫色氧化圈的显著程度筛选出4株漆酶活性较高的菌株,将这4株真菌进行摇瓶培养,测定并比较它们所产漆酶的活性,得到一株产酶活力最高的菌株SY04.菌株SY04在液体培养3d后粗酶液漆酶活力为330U/mL,在对其漆酶粗酶液进行活性分析后发现,该菌所产漆酶在60℃下保温30min后,活性不受明显影响,其最适反应温度为60℃.该菌所产漆酶具有较高的最适反应温度和热稳定性,具有一定的研究和应用价值.     

产漆酶菌株的筛选及产酶条件的优化

以愈创木酚培养基为底物,利用平板筛选法从土壤朽木中筛选能够产漆酶的菌株,通过测定漆酶活力进行复筛,筛选出一株产漆酶活力较高的白腐茵菌株。以漆酶活性为参考指标,确定葵花粉发酵产漆酶条件：发酵培养基中硫酸铵0．025％,初始pH值5．5,接种量8％,装液量50mL,愈创木酚0．10％,培养时间7d。     

纤溶酶高产菌株筛选及其液体发酵条件研究

研究实验室自主分离的2株纤溶酶高产菌株发酵条件,采用4因素、3水平的正交试验设计方法对液体发酵培养基的碳源、氮源、无机盐进行了优化,并对培养基初始pH、发酵时间、发酵温度对产酶量的影响进行了测定.结果表明:菌株1液体发酵合适的产酶培养基配方为大豆粉的质量分数为6%,葡萄糖2%,CaCl2 0.06%,MgSO4 0.07%;菌株2液体发酵合适的产酶培养基配方为大豆粉的质量分数为6%,玉米淀粉2%,CaCl2 0.06%,MgSO4 0.07%.培养基初始pH均为6.5时酶活性最高;发酵温度均以38℃最好;而菌株1和菌株2的适宜发酵时间分别为48～84 h和60～84 h.在优化条件下,菌株1、菌株2液体发酵最高酶活分别为306.46 IU/mL和319.76 IU/mL。     

产耐热过氧化氢酶菌株的筛选和培养

过氧化氢酶能催化过氧化氢的分解,在食品、环保、纸浆和造纸业、以及纺织行业具有重要的工业应用价值。研究从堆肥中分离了一株产过氧化氢酶的嗜热菌。该菌最适生长温度为55℃,最适生长pH值为7.0,最适NaCl浓度为1.5%。通过16S rDNA编码基因序列分析,该菌和环状芽孢杆菌有较高的同源性,命名为Bacillus sp.SHT2。通过对培养基中的碳、氮源进行优化,酶活达到196.9 U/mL。酶学性质研究表明该菌产生的过氧化氢酶具有良好的热稳定性、pH稳定性和储存稳定性。     

产单宁酶真菌的筛选及产酶条件

从铁冬青等4种植物的新鲜茎、叶组织中分离得到52株真菌,经平板透明圈法初筛得到18株产单宁酶菌株。初筛所得菌株经液体发酵,显示1株木霉属真菌(Trichoderma viride)(No.MYP07)酶活力最高,达0.248 μmol/(min·mL)。采用单因素结合正交实验,得到菌株MYP07的最佳发酵条件为：单宁100 g/L,蔗糖10 g/L,(NH4)2SO4 3 g/L,装液量为30 mL(250 mL锥形瓶),起始pH为5.0,温度30 ℃,转速140 r/min。在此条件下,菌株MY-P-07发酵48 h酶活力达到0392 μmol/(min·mL)。