小鼠精子微注射受精卵的体外发育与移植的研究

用显微注射方法,将精子注入小鼠卵母细胞卵周隙中,使精卵体外受精获得受精卵。并对精子注射后卵母细胞的成活率、受精率和受精卵的发育率以及移植后受胎率等方面进行了系统的研究,结果表明:卵子存活率为75.36％(1309/1737),其中264枚卵裂,受精率为20·17％(264/1309),卵裂卵经体外培养后有192枚发育到桑椹胚及胚泡期,发育率为72.73％(192/264)。将其中73枚(桑椹胚10枚,肛泡63枚)胚胎移植到10只假孕受体子宫中,一只受体妊娠产仔9只,仔鼠发育正常。     

原核显微注射产生转基因绵羊胚胎

体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养17 h,比较高速离心对胚胎发育的影响;高速离心可以使黑色脂滴甩到一边从而使受精卵原核清晰可见.然后将绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子和真核细胞表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)的载体DNA显微注射于绵羊受精卵雄原核中,并将异构胚在SOF液中发育培养.结果表明:高速离心组囊胚率低于对照组,但是没有显著性差异(P》0.05);显微注射外源基因2天后在激光共聚焦显微镜下可见荧光胚胎;PCR检测5个荧光胚胎均可见特异性条带.在原核显微注射生产转基因胚胎中,绿色荧光蛋白可作为标记基因进行早期胚胎筛选,为提高转基因动物移植效率奠定实验基础.     

牛体外受精技术研究的现状与展望

系统综述了牛体外受精技术研究的现状及存在的问题．并对今后的研究方向和前景提出了展望。牛卵母细胞可在不含血清的成熟培养液中获得受精及胚胎发育能力，促卵泡素、促黄体素及上皮细胞生长因子均对这一过程具促进作用。肝素是迄今最为有效的精子获能处理方法，但在受精过程中对精子获能起决定作用的是卵丘细胞和卵母细胞本身。提高受精质量可明显提高受精卵的胚胎发育能力。体外受精卵可通过改善培养条件或与体细胞进行复合培养发育到囊胚阶段．但后者更为稳定可靠。目前，牛卵母细胞的体外受精分裂率可达８０％，囊胚发育率达４０％左右．两枚鲜胚的移植妊娠率可达５０％～６０％．而两枚冻胚的移植妊娠率仅３０％～５０％。因此，尚需进一步提高体外受精胚胎的活力和改进胚胎的冷冻保存技术。     

羔山羊的超数排卵及体外受精

以ＦＳＨ或ＦＳＨ－ＬＨ四种不同处理方法对２９只６８～１１０日龄羔山羊进行超排处理，结果共采集卵泡卵母细胞７０８枚，平均每只羔羊采卵２４．４枚．卵母细胞经体外培养２４ｈ后有８１．２％的卵发育为成熟卵．分别用经钙离子载体Ａ＿（２３１７８）或肝素进行获能处理的精子对体外培养成熟的卵子进行体外受精，结果精子穿入卵率分别为５４．８％和３４．４％，发育至２～４细胞胚的卵裂率分别为２８．６％和４１．９％．采用ＦＳＨ－ＬＨ（肌注）进行超排处理得到的卵子经体外受精处理后，其卵裂率明显高于采用其它超排方法得到卵子的卵裂率．     

小鼠附睾精子的显微受精

目的：建立显微受精的方法,并探讨小鼠附睾精子在显微注射进入卵母细胞后的受精能力。方法：用显微注射法把小鼠附睾头和附睾尾精子注入卵母细胞的胞质内或卵周隙进行显微受精。结果：把单个附睾尾精子注入卵细胞质中,培养后１４个存活的卵细胞中,有５个卵裂为２－细胞期胚胎;将单个附睾头精子注入卵母细胞中,有２５个存活,其中９个受精发育为２－细胞期胚胎;将附睾尾精子注入卵周隙进行带下受精,３０个存活的卵细胞中有４个     

卵母细胞老化对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

就小鼠卵母细胞的卵龄对克隆胚的体外发育能力的影响进行了检测,以确定最佳的取卵时间,以及取卵后进行核移植操作的可耐受的时间。采用PMSG和hCG超排B6D2F1雌鼠。在体内老化实验中,分别于注射hCG后13,15,17,20h取卵用于核移植操作;在体外老化实验中,所有的卵均于注射hCG后13h取出并培养,然后在13,15,17,20h进行核移植操作。每个时间点的核移植操作在1h内完成,重构的胚胎培养1h后进行激活。结果显示:在体内老化实验中,注射hCG后13h取卵,获得的克隆囊胚发育率最高,为56.0%,15h取卵仍维持了其支持胚胎体外发育的能力,但17h及更长时间后取的卵,重构后的囊胚发育率显著下降(18.1%)。注射hCG后15h取的卵孤雌发育率最高(囊胚发育率为90.1%),并在17h仍维持较高的孤雌发育能力,在20h显著下降。在体外老化试验中,于注射hCG后13h取卵,分别于13,15,17h重构,都获得了较高的囊胚发育率(分别为57.7%,52.2%,46.3%),而在注射hCG后20h重构,囊胚发育率显著下降(14.8%)。体外老化的孤雌胚在注射hCG后22h激活时囊胚发育率显著下降。结果表明:卵母细胞在体内和体外老化都影响克隆胚的体外发育,最佳取卵时间为注射hCG后13h,取卵后立即用于重构可获得最佳囊胚发育率;体内、外老化卵支持重构胚较好发育的时间间隔是不同的,体内老化卵支持重构胚发育能力从注射hCG后17h开始下降,体外老化卵则发生在20h。这些结果可以指导操作,有利于在应用核移植进行其他基础研究时降低操作引起的误差。     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢，用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体，对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究，根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度，合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关，大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

微注射MT-hGH融合基因后,小鼠原核卵体外发育和移植的研究

用微注射方法,将MT-hGH融合基因注入昆明白小鼠原核卵的雄原核中,观察外源基因或其它成分(培养液,TE缓冲液),注入原核后对原核卵的存活率,卵裂率和体外培养条件下胚胎发育的影响。原核卵在雄原核内注入2pl MT-hGH基因悬液后存活率为86.17％,与只穿刺雄原核但不注射,注射培养液或TE缓冲液后存活率相近(分别为84.94％,84.49％和86.42％)。原核卵在注射MT-hGH基因后体外培养24h,活胚卵裂率显著降低(对照组为93.98％,注射组为87.96％P<0.01),注射MT-hGH基因组在体外培养下,2细胞胚到胚泡期的发育率明显低于对照组(分别为40.66％和64.09％,P<0.05)。注射组胚胎发育速度延缓。     

绵羊体外成熟,体外受精卵的体外发育及移植后的产羔

体外成熟、体外受精后的绵羊卵在体外长期培养或在2～4细胞期和桑堪～囊胚期移植给受体母羊,观察了培养卵的发育和移植后的受胎率。方法是将采自屠宰场的绵羊卵巢在1～12小时内带回实验室,抽取卵母细胞。从中选取卵丘细胞层完整的卵子,在二氧化碳培养箱内,用含有10％NSS(或FCS)、hCG和E_2,并以Hepes缓冲的M199培养24～26小时。再用以IonophoreA23187诱导获能处理过的新鲜公羊精于进行体外受精.7～10小时后移入发育培养基,即含有10％FCS(或NSS)和丙酮酸钠的Hepes缓冲的M199内继续培养,受精后将部分发育为2～4细胞胚和桑堪～囊胚期胚手术移植给受体母羊。另一部分卵子则在受精后48～72小时的不同时间内统计其卵裂卵的出现率,并继续培养7～12天详细观察卵裂卵的发育情况。在受精后48～72小时卵裂卵的出现率,FCS和NSS组分别为39.6％145/366)和52.4％(182/347),前者显著低于后者;将61枚2～4细胞期胚和桑椹～囊胚期胚分别移植给20只受体母羊,有10只受胎。共产羔11只,受胎率为50％;在发育培养液内继续培养的482枚卵裂卵中有312枚(64.7％)发育为桑椹～囊胚期胚(其中包括部分孵化囊胚)。     

牛体外受精胚胎成份明确培养系统的建立

以 SOF为基本培养液 ,分别添加血清、PVA以及同时添加 PVA、肌醇和柠檬酸钠 ,进行牛体外受精卵的发育培养 ,三个处理组的囊胚发育率分别为 :3 2 .6%、1 1 .9%和 1 5 .9% ,血清处理组极显著高于两个 PVA处理组 (p<0 .0 1 ) .在此基础上 ,将受精处理后的卵子去掉卵丘细胞后 ,培养于 SOF PVA 肌醇 柠檬酸钠培养液内 ,以未去掉卵丘细胞的卵子为对照 ,两个处理组的囊胚发育率分别为 1 0 .8%和 2 1 .1 % .二者间没有显著差异 .结果表明没有血清和卵丘细胞的成份明确的培养系统能够支持牛体外受精卵发育至囊胚阶段 .     

醋酸铅对小鼠受精能力及受精卵发育毒性研究

目的研究醋酸铅对公鼠精子受精能力及受精卵发育的毒性,为进一步研究提供依据。方法采用腹腔注射染毒法将体重为(18±2)g的性成熟期公鼠随机分为高剂量(1/10 LD50)、中剂量(1/50 LD50)、低剂量(1/250 LD50)染毒组和对照组。染毒组公鼠于试验的0,3,6,9 d和12 d分别腹腔注射1.2,0.24,0.048 mg/mL的Pb(CH3COO)2.3H2O溶液,注射量0.01 mL/g,对照组注射相应体积的灭菌蒸馏水。染毒30 d后用各组公鼠与未染毒超排母鼠配种。结果回收胚胎中受精并卵裂的胚胎比例随染毒剂量的增加而显著下降,未受精卵比例相应上升。在受精卵地进一步发育中,随着染毒剂量的增加,退化胚比例显著上升,发育到囊胚~孵化胚的比率则显著降低。结论醋酸铅能明显影响小鼠精子的受精能力,并影响受精卵的进一步发育。     

卵细胞体外成熟(IVM)在小鼠生物净化中的应用

目的 在小鼠生物净化中,从超排后未排卵的卵巢,取卵泡内未成熟卵采用卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)使之在体外成熟并具备受精能力,以提高卵子利用率和作为常规促超排失败的一种补救措施。方法 在小鼠生物净化中,取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢,在实体显微镜下划破卵泡挑选卵丘卵母细胞复合物(COCs),置于成熟液滴中在体外发育成熟。同时以注射PMSG和HCG后正常超排卵、只注射PMSG后取未成熟卵体外成熟和注射PMSG和HCG后取疑似成熟卵和裸卵体外成熟作为对照。经体外受精、体外胚胎发育后,将2-细胞胚移植到受体输卵管,使其在受体内发育成为成熟的个体。结果 注射PMSG和HCG后未排卵组(A组),卵细胞体外成熟率为87.0%±3.2%,二胞率为55.1%±12.3%,囊胚率为23.1%,移植41枚二细胞胚至2只受体鼠,出生5只幼崽,产仔率12.2%。只注射PMSG,48 h后取未成熟卵组(B组),体外成熟率为83.9%±3.9%,二胞率为51.8%±9.3%,囊胚率为38.5%±13.9%。注射PMSG和HCG正常超排组(C组),其二胞率为78.9%±0.6%,囊胚率为78.0%±3.8%。注射PMSG和HCG未排卵卵巢,取裸卵和疑似成熟卵(D组),体外成熟培养0 h,6 h和16～18 h,其成熟率、二胞率和囊胚率与其它三组相比均较低且有极显著性差异。A组和B组与正常对照C组相比,二胞率均有显著性差异,囊胚率均有极显著性差异。结论 卵母细胞体外成熟(IVM)可以作为小鼠生物净化中促超排失败的一种补救措施,并且可以提高珍稀品系小鼠的卵子利用率。     

胚胎的培养液平均拥有量和单独或群体培养对牛体外受精胚胎发育的影响

采用化学成分明确的培养系统,研究了胚胎的培养液平均拥有量以及单独或群体培养对牛IVF卵体外发育的影响.将牛体外受精(IVF)卵分别以每100、50和20μl培养液小滴内10枚卵子的形式进行发育培养,三个处理组的囊胚发育率分别为:6.0%、9.4%和14.3%,三者间无显著差异.在此基础上,选择培养效果较好的每枚胚胎2μl的培养液量,分别在20、10、4、2μl小滴内培养10、5、2、1枚胚胎,四个组的囊胚发育率分别为:10.0%、16.4%、10.0%、4.0%,5枚胚胎/10μl小滴处理组的囊胚率显著高于1枚胚胎/2μl处理组(p<0.05).研究结果表明:不同培养液拥有量以及单独或群体培养都可支持部分胚胎发育至囊胚阶段,降低培养液体积和群体培养更有助于牛IVF卵的体外发育.     

体外受精-胚胎移植及其衍生技术249个周期的临床研究

目的：总结本中心2年的体外受精-胚胎移植(IVF—ET)和单精子卵泡浆内显微注射(ICSI)技术研究及临床应用。方法：采用GnRHa／FSH/HOG和GnRHa／FSH/HMG／HOG、GnRHa／HMG/HOG及OCP/GnRHa／FSH/HOG四种超排卵方案治疗225对(249个周期)不孕夫妇。结果：取卵3383个。平均每周期取卵数13．59个;获受精卵3062个,受精率90．51％,卵裂率97．10％;249个周期植入胚胎762个,平均每周期移植3．06个。生化妊娠112例,临床妊娠95例,17例自然流产。截止目前已出生35个试管婴儿。其中。男婴14个,女婴21个,双胎妊娠4例,三胎妊娠2例。西北首例ICSI婴儿已1岁半,发育正常。结论：IVF—ET和ICSI是治疗不孕症的一种有效手段,特别是根据患者年龄、体重、卵巢功能状态及子内膜等因素。选择不同的超排卵方案和应用不同的药物剂量。随着技术中各个环节的进一步提高和完善,妊娠率会不断提高。     

精子和酒精对小鼠卵母细胞激活的比较

对不同卵龄的小鼠卵母细胞被精子和酒精激活后的激活率进行了比较。结果显示,卵母细胞对常规的体外受精和酒精的人工激活的激活率存在卵龄的差异。注射hCG后15～24h的卵母细胞容易被酒精的人工刺激所激活,20h卵龄的卵母细胞激活率最高,平均为81．6％,且速即卵裂率也最高,平均为48％,卵龄更大的卵母细胞激活率降低,而13h的卵母细胞难以被酒精激活。另一方面,13～15h的卵母细胞容易被精子激活而受精,卵龄较大的卵母细胞在体外难以被精子激活受精。这表明,精子和酒精对卵母细胞的激活机制有所不同。     

通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的研究

以羔羊卵巢卵母细胞为材料,所体外受精技术应用到绒山羊育种工作中,观察了羔羊登攀上受精卵的体外发育及移植产羔的效果,以便探讨通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的技术途径,对４０６枚羔羊体外受精卵用Ｍ１９９＋ｈｃＧ,Ｍ１９９＋ＬＨ和Ｍ１９９＋ｈｃＧ＋ＥＧＦ三种培养进行体外发育培养,结果２～４细胞期胚的发育率平均分别为４０．０％,４３．６％和４９．６％,桑椹胚和囊胚的发育率平均分别为１７．５％,１５．８     

切割采卵法及牛卵巢深层卵泡卵母细胞的体外受精

为提高牛体外受精(BIVF)过程中屠宰牛卵巢的利用率,本研究将采集的110个牛卵巢先用常规的注射器抽吸法采卵后,再用刀片切割法采集了位于深层的卵泡卵母细胞,并对两种方法回收的卵子分别进行了BIVF实验。结果表明,在先用抽吸法采卵每头牛可得到9.88±2.42枚可用卵子的基础上,切割法采卵又可获得平均8.74±3.48枚可用卵子。这使得平均采卵数达到了每头牛18.62±2.59枚。体外受精后,由切割法回收的深层卵子其卵裂率和桑椹胚、囊胚发育率分别为43.01％(160/372),14.24％(53/372)和10.48％(39/372),均明显低于抽吸法回收卵的73.62％(201/273)、31.14％(85/273)和19.05％(52/273),(P<0.01)。本研究证明了抽吸后再切割的两次采卵法对提高牛卵巢采卵效率有着明显的效果,而且这部分深层卵泡卵母细胞用于体外受精后可发育为正常的早期胚胎,但各项发育指标尚有待于进一步提高。     

冷冻保存对人类附睾精子功能的影响

目的：了解人类附睾精子经历冷冻保存后的精子功能变化。方法：应用精子功能检测方法。结果：１１ 例先天性双侧输精管缺如患者附睾精子标本冷冻保存后,每例冷冻标本均见活动精子,但精子活动率显著降低,精子活动能力减弱。精子膜完整率显著下降,头膜损伤－ 尾膜完整的精子率（ Ⅲ型精子） 显著升高,精子体外存活时间显著缩短。精子顶体蛋白酶活性降低。去透明带地鼠卵穿透试验检验精子体外授精能力失败的标本,采用显微注射技术可使精子辅助授精。结论：（１） 冷冻保存对附睾精子功能有显著的影响,造成精子功能减弱;（２） 冷冻精子仅用单一尾膜肿胀试验筛选,有可能拾取到的是尾膜完整,但头膜损伤的精子;（３） 建立显微授精技术可有效地对冷冻附睾精子辅助受精。     

不同发育阶段小鼠胚胎在体外形成单卵双胚的比较

小鼠早期胚胎在去掉其透明带后,用吸管(2—和4—细胞卵)或微针(8—细胞卵和桑椹胚)作显微手术,将胚胎平分,产生“半胚”,然后在Whitten氏液中培养。比较了不同发育阶段小鼠半胚在体外的发育能力。2—、4—、8—细胞卵和桑椹胚在显微分割后,分别有26.9％、13.0％、48.8％和29.2％的半胚正常发育,其中8—细胞卵的半胚在体外的发育结果最好。显微操作对2—和4—细胞卵的损伤程度较低,对8—细胞卵和桑椹胚的损伤程度较高。获得了同卵半胚对在体外的正常发育结果,约有18％来自桑椹胚的半胚对和近23％来自8—细胞卵的半胚对发育正常。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育的比较

目的对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活,可以间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%,17.7%)明显高于体外成熟21 h或24 h的囊胚发育率(12.3%,13.8%);Ion联合6_DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同培养条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(21.7%,13.0%)。