动物基因工程慢病毒载体--一种将传染性病毒颗粒转变成基因治疗的载体

慢病毒载体是一类逆转录载体,它既能感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞.也就是说,它能够广泛地应用于基因治疗,构建转基因动物和结合RNAi技术进行基因功能研究.     

动物基因工程慢病毒载体——一种将传染性病毒颗粒转变成基因治疗的载体

慢病毒载体是一类逆转录载体,它既能感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞.也就是说,它能够广泛地应用于基因治疗,构建转基因动物和结合RNAi技术进行基因功能研究.     

慢病毒及其载体系统研究进展

基于慢病毒的病毒载体的研究已经发展到一定水平,因此用慢病毒作为基因转移媒介的临床研究已经开始,在实验室和临床应用中,慢病毒具有特别的优点,尤其是能整合未分裂细胞的独特能力.现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经开始应用于人体.本文介绍基于HIV-1的慢病毒和慢病毒载体的结构,慢病毒载体的优点以及慢病毒载体应用的展望.     

用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架,携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒,通过小鼠受精卵卵周隙注射,将其感染小鼠受精卵,经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术,证明了GFP基因的整合率达到40%以上;实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40;染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的,并通过交配可将外源基因遗传至子代,获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

基因治疗中病毒载体的研究进展

目的:在基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段得到了迅速发展的同时,探讨病毒载体在基因治疗中的应用。方法:通过对各种病毒载体的改造和完善,扩大其载体容量,提高基因的转染效率和克服体内的免疫反应等手段,可使病毒载体的应用更加符合临床的需要。结果:改造过的病毒载体大大提高了载体靶向的特异性和应用范围。结论:病毒以其独特的生物学特性作为基因治疗载体有着独特优势,在临床上得到了广泛应用。     

慢病毒载体转染犬睾丸生殖细胞

摘要: 目的观察慢病毒载体( Lentiviral vector,LV) 对犬生殖细胞的转染,为基于LV 的精子介导法制备转基因动物提供依据。方法采用睾丸打点注射法,向比格犬两侧睾丸分别注入滴度为5 × 108、1 × 108、2 × 107 TU /mL 的慢病毒液组成3 个剂量组,每点注射量为每只犬0. 2 mL。于注射后第2 周开始采集精液,通过精液DNA 的PCR 检测和精子荧光镜检评估绿色荧光蛋白( green fluorescent protein,GFP) 基因的整合及表达。结果1) 在高剂量组,整合并表达GFP 基因的精子于第4 周首现并持续至第17 周; 在中、低剂量组于第5 周首现,分别持续到第14 周、12周。2) GFP 表达的高峰期在注射后第7 周～ 10 周。3) GFP 表达于整个精子,以顶体后区和精子尾颈部表达最强。4) 注射后第2 周～ 6 周,中剂量组犬采精困难,高低剂量组犬精子畸形率有上升的趋势。5) 在GFP 表达的高峰期,绿色荧光精子的百分率在高、中、低剂量组分别为43. 33% 、35. 53% 和4. 55% ,具有明显的差异。结论基于LV 的精子介导转基因法( Sperm-mediated gene transfer,SMGT) 可成功获得转基因犬精子,转基因阳性率、表达的强度与持续时间与慢病毒滴度相关。     

慢病毒载体感染小鼠曲细精管的研究

目的探讨基于慢病毒载体曲细精管注射方法建立转基因动物的可行性。方法将8只4w～5w龄的雄性昆明小鼠分为高剂量(2只)、低剂量(6只)2个实验组,曲细精管注射滴度分别为1×109、2×107TU/mL的绿色荧光蛋白慢病毒载体(LV-GFP),注射量均为20μL/testis。注射后第4w、8w分别处死高剂量组小鼠各1只,于第5w、13w、17w各处死2只低剂量组小鼠,取睾丸,通过PCR、荧光显微镜和免疫组化等方法检测睾丸组织中GFP基因及表达。结果3只低剂量和2只高剂量小鼠睾丸组织中均可检测到GFP基因;但GFP表达仅见于高剂量组小鼠睾丸,其分布范围主要集中于曲细精管基膜及管间隙。结论慢病毒载体可通过曲细精管注射感染小鼠睾丸组织,但其感染效率与病毒滴度有关。     

基因治疗载体的研究进展

基因治疗已经开始用于肿瘤、癌症及各种遗传性疾病的治疗当中,临床效果已经开始显现,且应用前景广阔。基因治疗的关键是采用适宜的载体材料将外源基因传递至受体靶细胞中,本文总结了基因治疗中常用的病毒、非病毒载体,报道如下。     

慢病毒载体冻干制剂的制备与稳定性研究

制备了一种新型慢病毒载体冻干制剂.通过冻干保护剂处方的筛选与优化,从外观、赋形性、色泽度、溶解性方面评价冻干制剂的理化性质,确定最优处方为海藻糖0.30 g/mL、L-组氨酸0.31 mg/mL、L-丙氨酸0.178 mg/mL、CaCl20.020 mg/mL、MgSO40.015 mg/mL.所制备的慢病毒载体冻干...     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

腺病毒介导的bFGF基因对大鼠大脑中动脉闭塞模型的作用

采用改良的Zea Longa法制备大鼠脑缺血模型,研究腺病毒介导的bFGF的基因治疗对大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型的治疗作用及脑血管发生的影响,将30只SD大鼠随机分为假手术组、空载体组（Ad-null组）和治疗组（Ad-bFGF组）,于造模成功后24h尾静脉给药.检测实验各组脑组织含水率的变化,通过核磁共振的和免疫组化分别检测实验各组大脑梗死体积和血管发生的变化.结果发现治疗组大鼠脑组织含水率和脑梗死面积明显小于空载体组,脑血管密度显著高于空载组.说明腺病毒介导的bFGF基因卡显著减小脑组织含水率和脑梗死面积,促进脑部血管发生,为缺血性脑卒中的基因治疗提供了新的途径.     

以新换旧--用独立通风笼盒(IVC)取代弹性薄膜隔离器

独立通风笼盒是应生物密封标准不断提高的需要而发明的。这些笼盒为动物提供了一个密封的环境 ,并且对空气携带的污染物的阻断也有很大的帮助。由于转基因动物增多 ,独立通风笼盒应用越来越广泛。它能有效地预防交叉污染 ,并且能可不同来源的动物住在一块 ,而不需要考虑它们的健康状况。本篇将对独立通风笼盒和弹性薄膜隔离器做一个比较。传统的弹性薄膜隔离器被用来把健康状况已经明确的动物放在一起 ,如 ,悉生动物和无菌动物。隔离器是二战时期特雷克斯勒和雷尼尔为研究恙虫病时发明的。如今 ,用隔离器来给动物提供住处经常会遇到这样的问…     

血友病B基因治疗进展

血友病B是一种严重的凝血功能缺陷遗传病，由于现行的治疗方法对血友病B的治疗效果均不令人满意。因此，有必要开展血友病的基因治疗研究。本文介绍了血友病B的发病机理以及以反转录病毒载体为工具进行血友病B基因治疗的研究进展。     

基于Cre-LoxP系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建与鉴定

目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ires TK慢病毒载体为模板,用Spe I与Kpn I进行双酶切,去除TERT-ires TK片段,然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接,构建p LOX-MCS表达载体.同时,以p B513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro表达框(带有Bam HI及Kpn I酶切位点),然后与经过Bam HI及Kpn I双酶切的p LOX-MCS载体连接,进而构建p LOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称p LOX-CMV-E/P)载体.将p LOX-CMV-E/P载体与慢病毒包装载体p CMVR8.74及p MD2.G共转染293T细胞,包装病毒进行报告基因的功能分析.结果:菌落聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致,绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能.结论:成功构建了p LOX-MCS及p LOX-CMV-E/P慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统.     

基因治疗及其研究进展情况

本文综述了基因治疗的步骤,基因治疗的对象及基因治疗的现状及前景。基因治疗的步骤包括基因诊断;治疗基因与载体的连接;基因转移。其中载体是基因治疗中的一个重大关键技术问题。目前基因治疗已进入理性化阶段,世界上许多国家对基因治疗前景看好,投资加强。     

马铃薯转基因株系载体骨架的整合分析

对衍生于常用载体pBI 121的4种表达载体所获得的马铃薯转基因株系进行了PCR骨架整合分析,结果表明,左边界序列和短片段骨架基因更容易整合进基因组中,转入基因组的载体骨架片段的大小也不一样.这说明在转基因植株的检测中要注意骨架载体是否转入,以便消除生物安全性问题.     

转基因植物中外源基因的沉默

在转基因植物中外源基因不能正常表达,呈失活状态的现象称为基因沉默。造成基因沉默的因素主要有插入位置、重复序列和甲基化。基因沉默一般可以归为转录水平和转录后水平上。外源基因沉默阻碍了植物转基因技术在生产上广泛应用,根据对大量转基因植物的分析和研究,人们提出了造成基因沉默的可能机制,如ＲｄＲＰ－ｃＲＮＡ模型、ＲＮＡ阈值模型以及ＲｄＤＭ模型等。深入了解外源基因沉默的机制以提高基因表达效率,是顺利开展植物     

人类基因治疗的研究进展

人类基因治疗是遗传工程在人类疾病治疗方面的应用，该方法是应用遗传工程的方法，将正常基因导入患者的体细胞内，使其在细胞内得到一定的表达，产生正常的基因产物以补尝或修正突变基因的功能，从而使人类的遗传病得到根治，本文对人类基因治疗研究中受体细胞的研究、基因转移方式等方面的最新研究进展作一综述，并对其存在的问题及应用前景进行了初步展望．