小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

羔山羊的超数排卵及体外受精

以ＦＳＨ或ＦＳＨ－ＬＨ四种不同处理方法对２９只６８～１１０日龄羔山羊进行超排处理，结果共采集卵泡卵母细胞７０８枚，平均每只羔羊采卵２４．４枚．卵母细胞经体外培养２４ｈ后有８１．２％的卵发育为成熟卵．分别用经钙离子载体Ａ＿（２３１７８）或肝素进行获能处理的精子对体外培养成熟的卵子进行体外受精，结果精子穿入卵率分别为５４．８％和３４．４％，发育至２～４细胞胚的卵裂率分别为２８．６％和４１．９％．采用ＦＳＨ－ＬＨ（肌注）进行超排处理得到的卵子经体外受精处理后，其卵裂率明显高于采用其它超排方法得到卵子的卵裂率．     

生长因子对牛体外受精卵体外发育的影响

本研究探讨了在成熟培养液和发育培养液内添加ＥＧＦ和ＴＧＦ－α对牛体外受精卵发育的影响，在成熟培养液内分别添加ＥＧＦ和ＴＧＦ－α，经体外受精处理后卵裂率分别为７８．３％和８２．６％，显著高于对照组６０．２％的卵裂率；三个处理组囊胚发育率分别为１９．６％、２４．５％和１８．７％，三者间无显著差异．在发育培养液内分别添加ＥＧＦ和ＴＧＦ－α，其囊胚发育率分别为３０．０％和２３．４％，与对照组２１．０％的囊胚发育率相比差异不显著．在成熟培养液内添加ＴＧＦ－α，在发育培养液内添加ＥＧＦ，经这两种生长因子分别作用后，体外受精卵翼胚发育率为２１．０％，与单独使用其中一种生长因子相比囊胚发育率无明显提高．     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢，用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体，对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究，根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度，合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关，大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

卵母细胞的不同对牛体外受精效果的影响

为了进一步提高牛体外受精（ＢＩＶＦ）胚的发育率，探讨了来自不同大小卵泡、具有不同卵丘细胞层数以及细胞质形态不同的卵母细胞对牛体外受精效果的影响。结果表明：１）分别采自直径大于５ｍｍ、２￣５ｍｍ和小于２ｍｍ的卵泡的卵母细胞，经体外成熟、体外受精后，卵裂率分别为５４．５％（３０／５５）、６４．４％（８５／１３２）和５０．４％（６３／１２５）。其中，２￣５ｍｍ卵泡的卵母细胞的体外受精结果显高于小于２ｍ     

灭活与未灭活发情母牛血清对牛体外受精卵发育的影响

通过在成熟培养液和发育培养液内添加灭活或未灭活发情母牛血清（ＯＣＳ）探讨了血清灭活与否对牛体外受精（ＢＩＶＦ）卵发育的影响，在卵母细胞成熟培养实验中，两个组分别添加１０％灭活、未灭活发情零日母牛血清（Ｄ＿０ＯＣＳ），另一组为不加血清的对照组。三个处理组的卵裂率分别为７４．８％、７６．５％和５０．２％（Ｐ＜０．０１）。囊胚发育率分别为２５．９％、１８．３％和４．８％（Ｐ＜０．０５）。前两个处理组间无显著差异，但二者的各项发育指标均显著高于对照组。在发育培养液内分别添加５％灭活或未灭活发情第五日母牛血清（Ｄ＿５ＯＣＳ）。两个处理组的卵裂率分别为７６．７％和７２．０％，囊胚发育率分别为２４．５％和２０．１％，二者间无显著差异，结果表明：牛卵母细胞的成熟过程中，血清的添加是必须的。未灭活ＯＣＳ同样可以促进ＢＩＶＦ卵的体外发育，但其效果仍不如灭活的ＯＣＳ．     

不同体外培养条件对牛体外受精胚胎质量影响的研究

研究探讨了不同体外培养条件下牛体外受精胚胎的发育速度及囊胚细胞数，从而了解不同体外培养系统对牛体外受精胚胎质量的影响，实验一中伴体外受精卵分别在ＳＯＦ＋牛输卵管上皮细胞（ＢＯＥＣ）和ＴＣＭ１９９＋ＢＯＥＣ两种培养系统内培养，在这两种培养条件下囊胚发育率分别为２２．２％和２１．２％，囊胚细胞数分别为１１３．３±５．０和９７．９±８．３，受精后第６～９ｄ的囊胚出现率分别为４０．１％，３７．０％，１９．     

羔山羊卵泡的发育及卵母细胞体外成熟的研究

为利用羔羊作供胚羊，采用三种超数排卵的方法，对出生后４０～１５０日龄的羔山羊进行超数排卵处理以后，从活体采集卵巢卵母细胞在体外进行了培养．研究结果表明，采用超数排卵的技术能够诱导未性成熟羔山羊的卵巢卵泡的发育，由超排后采集到的羔山羊卵泡卵母细胞经体外培养有继续发育成熟的能力．适宜的超排方法为ＦＳＨ１０ｍｇ＋ＬＨ１．５ｍｇ（肌肉注射），羔山羊适宜的超排日龄为４０～９０ｄ，卵母细胞的体外适宜培养时间为１８～２８ｈ．     

牛体外受精技术研究的现状与展望

系统综述了牛体外受精技术研究的现状及存在的问题．并对今后的研究方向和前景提出了展望。牛卵母细胞可在不含血清的成熟培养液中获得受精及胚胎发育能力，促卵泡素、促黄体素及上皮细胞生长因子均对这一过程具促进作用。肝素是迄今最为有效的精子获能处理方法，但在受精过程中对精子获能起决定作用的是卵丘细胞和卵母细胞本身。提高受精质量可明显提高受精卵的胚胎发育能力。体外受精卵可通过改善培养条件或与体细胞进行复合培养发育到囊胚阶段．但后者更为稳定可靠。目前，牛卵母细胞的体外受精分裂率可达８０％，囊胚发育率达４０％左右．两枚鲜胚的移植妊娠率可达５０％～６０％．而两枚冻胚的移植妊娠率仅３０％～５０％。因此，尚需进一步提高体外受精胚胎的活力和改进胚胎的冷冻保存技术。     

完全体外化牛细胞核移植的研究

本研究探讨了用体外成熟卵母细胞和体外受精胚胎进行核移植的可能性。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。从屠宰场回收的卵巢中抽取卵球－卵母细胞复合体，采用以前报道的方法（石德顺等，广西农业大学学报’１９９４：１３：１－５）进行体外成熟（ＩＶＭ）和体外受精（ＩＶＦ），获得ＩＶＭ卵母细胞和ＩＶＦ胚胎，体外成熟２３－２４ｈ后，在含０．１％透明质酸酶的无钙镁ＰＢＳ（ＰＢＳ）内，用细管反复吹打去掉卵丘细胞。选择具有明显第一极体的卵母细胞通过显微操作移去第一极体及其附近约一半的细胞质进行去核，去核的卵细胞在成熟液内继续培养到ＩＶＭ３０ｈ．体外发育到８－３２细胞期的ＩＶＦ胚胎用作核供体．供体胚胎用含０．２５％Ｐｒｏｎａｓｅ（溶于ＰＢＳ￣－）溶解透明带，并用细管吹打将其分散成单个卵裂球，在ＩＶＭ３０ｈ将单个卵裂球显微注入去核卵母细胞的卵周隙内，并在ＩＶＭ３１ｈ用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲（间隔１秒）来诱导卵裂球与去核卵母细胞的融合。融合卵在颗粒细胞单层培养滴内共培养，体外培养２４ｈ后观察卵裂结果，经体外培养５－８天后发育到桑椹和囊胚的核移植胚胎移植到同期发情的受体．２个月后直检妊娠情况．本实验中共操作１９４枚卵母细胞，     

小鼠卵巢颗粒细胞条件培养液中蛋白质和激素水平

测定用于精子顶体反应和早期胚胎离体培养的小鼠卵巢颗粒细胞条件培养液中的蛋白质和激素水平。结果表明：单层培养的颗粒细胞体外培养后生长良好,能稳定分泌蛋白质、雌二醇（Ｅ２）和孕酮（Ｐ）。在培养液中加入促卵泡素（ＦＳＨ）和胰岛素（ＩＮＳ）时,Ｅ２的分泌量无显著变化。     

The Effects of Different Culture Systems on the Quality of Bovine In Vitro Fertilized Embryos

研究探讨了不同体外培养条件下牛体外受精胚胎的发育速度及囊胚细胞数，从而了解不同体外培养系统对牛体外受精胚胎质量的影响．实验一中将体外受精卵分别在ＳＯＦ＋牛输卵管上皮细胞（ＢＯＥＣ）和ＴＣＭ１９９＋ＢＯＥＣ两种培养系统内培养，在这两种培养条件下囊胚发育率分别为２２．２％和２１．２％，囊胚细胞数分别为１１３．３±５．０和９７．９±８．３，受精后第６～９ｄ的囊胚出现率分别为４０．１％ａ、３７．０％、１９．２％ｂ、２．７％和１３．５％ｃ、３２．７％、３６．５％ｄ、１７．３％（ａ＞ｃ，Ｐ＜０．０１，ｄ＞ｂ，Ｐ＜０．０５），表明牛体外受精卵在ＳＯＦ＋ＢＯＥＣ中的发育速度快于在ＴＣＭ１９９＋ＢＯＥＣ中．实验二中将体外受精卵分别培养于ＳＯＦ＋ＢＯＥＣ、ＳＯＦ＋牛卵丘细胞、ＳＯＦ＋ＢＳＡ三种培养系统中，结果囊胚发育率分别为３５．５％ｅ、２９．４％和２２．４％ｆ（ｅ＞ｆ，Ｐ＜０．０１），囊胚细胞数分别为１１７．３±８．０ｇ、９４．２±９．３和９０．２±９．４ｈ（ｇ＞ｈ，Ｐ＜０．０５）．实验三观察了体外受精胚胎在ＳＯＦ＋ＢＯＥＣ培养条件下发育速度与囊胚细胞数的关系，结果第６～９ｄ的囊胚细胞数分别为１１０．８±１０．２ｉ、１２８．     

小鼠未成熟卵母细胞体外培养

目的：探讨小鼠未成熟裸卵体外培养,获得较高的成熟率和受精率的适宜培养时间和培养条件。方法：在培养液中添加不同剂量的人绝经期促性腺激素（hMG)和卵泡刺激素（FSH）,分别培养从未行激素刺激排卵处理的昆明系小白卵巢中获得的未成熟裸卵,培养24h和48h后,进行体外受精和胚胎培养,结果：添加不同激素和培养不同时间对未成熟裸卵的体外成熟无显著性影响（P＞0．05）,但黄体生成素（LH）的存在对培养48h后成熟卵子的体外受精率有显著性影响（P＜0．05）,并随LH含量的增多,影响也越大。结论：未成熟裸卵能在体外培养成熟并受精,但培养液中LH含量对培养较长时间的成熟裸卵的体外精率有极显著的不利影响。     

"两步法"体外培养山羊卵母细胞的初步研究

体外成熟培养的卵母细胞经本外受精后，囊胚发育率远低于体内成熟卵母细胞，原因之一是由于体外成熟卵母细胞的不充分获能造成的，有假说认为：卵母细胞在体外培养过程中，如果延长GV期，可促进卵母细胞进一步获能，从而提高发育潜能。本文以山羊卵子为研究对象，探讨了山羊卵泡各种成分以及异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制以及抑制解除后减数分裂的影响，结果显示，山羊50％Q卵泡液、100％卵泡液、半卵泡、打孔整体卵泡以及完整卵泡对山羊卵母细胞的核成熟抑制率分别为：0.00%、9.38%、60.47％、78.26%和70.09%，随后，对经山羊半卵泡、打孔整体卵泡、完整卵泡抑制培养后的卵子进行恢复培养发现，卵子核成熟率分别为：64.29%、3.49%和4.13%，山卵母细胞与半卵泡共培养24h后进行0h、12h、20h、24h和30h的恢复培养，核成率分别为：0.00%、20.00%、61.90%、64.29%和43.75%，表明山羊半卵泡可以有效抑制山羊卵母细胞使之处于GV期，并且这种抑制作用可以恢复，恢复培养时间以20h和24h较为适宜，初步研究异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制的影响发现，50％牛卵泡液、1005牛卵泡液、50％绵羊卵泡液、100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制率分别为3.7%、21.88%、10.00%、58.82%，表明，100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制效果较好。     

小鼠卵泡卵母细胞体外成熟培养基的选择

试验选用30只昆明小白鼠,采出卵巢回收卵泡卵母细胞,分别在培养基WM、TALP、M-199、mD-PBS和BMOC-3中培养。小鼠卵泡卵母细胞在五种培养基中的发育率都在81％以上,统计处理之间都没有显著差异。但成熟率差异明显,其中WM最高(65.7％),BMOC-3最低(18.2％),TALP、M-199和mD-PBS则相近,三者的成熟率分别为37.1％、37.5％和38.5％。试验资料表明WM是小鼠卵泡卵母细胞体外成熟的最佳培养基。     

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

采用体外培养和冷冻保存的方法将起排处理后的绒山羊２～８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和，Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植．结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处理组中分别为１２．５％、７０．６％、８１．８％和７３．９％，对照组与添加ＯＥＣ处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），囊胚发育率在添加ＦＣＳ、ＥＮＧＳ和ＮＳＳ的实验组之间无明显差异．经冷冻保存的桑椹胚和早期囊胚的冷冻解冻胚的形态正常率在甘油、乙二醇和玻璃化三个冷冻处理组中分别为７５．０％、８６．７％和７５．０％，发育率分别为５８．３％、７８．８％和８０．０％．冷冻解冻胚的移植妊娠率在三个处理组中分别为５０％、７５％和５０％，产羔率分别为３０％、６８．８％和５０％．采用乙二醇冷冻绒山羊胚胎产生的效果优于甘油和玻璃化方法的冷冻效果。     

小鼠腔前卵泡无血清体外培养的研究

目的:探索添加物维生素C和促性腺激素对小鼠腔前卵泡卵母细胞体外生长发育的影响及适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系.方法:通过改良的TCM199无血清培养系统,在96孔细胞培养板中,每孔放入1个腔前卵泡等条件下体外培养腔前卵泡卵母细胞.结果:随着培养时间的延长,各组卵泡和卵母细胞的直径都不同程度的有所增长,其中FSH400+LH200组和VC50+FSH400+LH200影响均大于VC50和对照组,存在显著性差异(P0.05),但二者之间无显著性差异.FSH400+LH200质量浓度组卵泡存活率、发生GVBD率和第一极体排出率均最高,分别为68.6%、17.6%、9.8%.但VC50+FSH400+LH 200组卵泡成腔率最高,为48%.结论:在改良的TCM199无血清培养系统中,联合添加促性腺激素和抗氧化剂后,卵泡成腔率大有提高,卵泡存活率、发生GVBD率和第一极体排出率仅次于单独添加促性腺激素组.     

犬卵母细胞体外成熟培养前后的超微结构变化

从屠宰场采集犬卵巢，收集间情期（不可见卵泡）和发情期卵巢卵母细胞。成熟培养前，其超微结构有以下特征：间情期犬卵母细胞与卵丘细胞间以及卵丘细胞之间通过胞质突起相连，胞质中的主要细胞器是线粒体和脂滴，质膜下有发达的粗面内质网；囊状卵泡的卵母细胞，结构近似于间情期犬卵母细胞，但细胞间连接更为普遍，胞质中细胞器更加丰富，并出现零星的皮质颗粒。经ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ体外培养３６ｈ后，微绒毛、线粒体、滑面内质网、皮质颗粒等细胞器增多，胞质内细胞器向皮质区迁移，核仁发生致密化。体外培养７２ｈ后，卵母细胞进一步成熟，表面微绒毛由倒伏状变得细长且坚起，皮质颗料沿质膜下呈线行排列，线粒体分散于皮质中央     

体外培养绵羊卵母细胞核质成熟的研究

实验通过研究卵母细胞的核相及皮层颗粒的分布,探讨按照卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后的不同绵羊卵母细胞在体外培养过程中的核质成熟情况,结果表明：（１）小卵泡卵经体外２４ｈ后的核质成熟率分别为４５．９％和２８．２％,远低于大（９３．５％,６６．７％）、中（８５．１％,５１．０％）两类卵泡卵,２）大卵泡卵在体外培养２０ｈ已完成核质成熟,较中等卵泡提前４ｈ。３）ｇｋｐｈｅ ３ｎｆｃ ｃ ｈ ｇｃｆｔ ｐｎ     

小鼠集落刺激因子（CSFs）的体外诱导研究

用体外淋巴细胞培养系统，对一些非淋巴因子诱导小鼠脾细胞产生集落刺激因子（ＣＳＦｓ）进行研究的结果发现，静止的小鼠脾细胞对原激酶（ＵＫ）不产生应答，只有当ＣｏｎＡ刺激后才能产生ＣＳＦｓ；表皮生长因子（ＥＧＦ）与ＣｏｎＡ协同作用能明显诱导ＣＳＦｓ的产生．人绒毛膜促性腺激素（ＨｃＧ）可直接作用于静止的脾细胞，使其产生ＣＳＦＳ．剂量依赖试验表明当ＵＫ为１６００ＩＵ／ｍｌ，ＥＧＦ为２０ｎｇ／ｍｌ，ＨＣＧ为４００ＩＵ／ｍｌ时所诱导的ＣＳＦｓ活性达到最高值．此外，ＣＳＦｓ的诱导还具有时间依赖关系．ＵＫ作用６０ｈ，ＥＧＦ和ＨＣＧ作用４８ｈ诱导产生的ＣＳＦｓ活性达到最高值．ＨＣＧ抗体中试验进一步说明ＨＣＧ可直接作用于脾细胞．联苯胺染色结果表明ＵＫ．ＥＧＦ和ＨＣＧ诱导的条件培养液中均不含红系集落刺激因子．