SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。     

中华鳖病原菌菌种的分离鉴定及多重PCR的初步建立

对患病中华鳖心脏、肝脏、肠道中分离得到的疑似致病菌株进行常规生理生化鉴定,同时采用分子生物学鉴定方法,设计细菌16srDNA保守区通用引物,进行基因扩增及序列比对,建立并优化多重PCR反应条件.分离鉴定出4种病原菌:迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,Et)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii,Cf).多重PCR检测体系敏感性与特异性良好,证明多重PCR是一种能快速准确鉴定多种中华鳖致病菌的方法,且操作简单、灵敏度高、稳定性和重复性好.     

兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

目的 建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法 本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域，设计3对特异性引物，以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度，构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量；以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性；通过批间和批内实验验证其重复性；经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较，评估其临床应用效果。结果 最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMD-Sa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高；该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带，对其他病原体均无扩增条带，表明特异性较强；...     

李坏死环斑病毒检测方法的比较研究

针对感染李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）植株病毒的特异性检测,将DAS—ELISA、RT—PCR方法综合改进、优化,建立了免疫捕获反转录PCR（IC—RT—PCR）检测PNRSV的方法．该方法采用PNRSV抗体特异性免疫捕获病毒,并根据GenBank中PNRSV序列设计的特异性引物对PNS／PN3进行PCR扩增,得到约760bp大小的特异性基因片段．扩增产物经克隆测序后,结果表明：产物序列与PNRSV的外壳蛋白编码基因存在94％～98％的同源性．检测广泛性以及灵敏度比较研究显示,IC—RT—PCR方法能从含量很低的受病样品中检出PNRSV,检测灵敏度与RT—PCR相近,但所检测样品的范围更广,适用于从植物各部位检测低含量的病毒．IC—RT—PCR检测灵敏度比DAS—ELISA方法高出1000倍．     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。     

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对Gen Bank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物. PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.     

多重PCR检测病死鸡中沙门氏菌方法的研究

为了建立能够同时检测病死鸡样品中的沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的多重PCR 方法.采用煮沸法提取 DNA 做为模板,选择分别针对沙门氏菌属、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的特异性基因(invA、fliC、sdfⅠ)设计引物,优化反应体系和反应参数,建立多重PCR检测方法.应用该方法对国内17家鸡场369份病死鸡样品进行沙门氏菌的检测,检测结果与传统细菌培养法的结果进行比较.结果表明,优化过的多重 PCR 可同时对沙门氏菌种、属进行鉴定,灵敏度为4.6×102 CFU/mL;多重 PCR 方法共检测出沙门氏菌34株,其中鸡白痢沙门氏菌21株、肠炎沙门氏菌5株,与传统细菌培养法检测结果的符合率分别为91.2%、90.5%和80.0%.     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和Nos方法的建立

根据商品化转基因作物中常用的花郴花花叶病毒启动子（CaMV35S）和根癌农杆菌终止（Nos）的序列特点，设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针，建立一种应用荧光双链探针的多重荧光PCR同时检测转基因成分35S启动子和Nos终止子的方法，并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等11份实物样品进行了检测，其中有5份样品结果阳性，结果表明所建立的多重荧光PCR方法能同时检测了35S方法同时检测出35S和Nos双组分，较常规PCR技术更为简便、快速、准确，有很很好的应用前景。     

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS序列，设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC—JB01S和DC—JB01x，并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别．在进行位点特异性PCR鉴别之前，首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增，以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度．当退火温度上升为64℃，只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来，而其它的37种石斛属植物均为阴性．该鉴别反应重复性好，已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用．与DNA测序鉴别方法相比，位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点．     

采用基因芯片技术筛查农作物转基因背景

采用基因芯片技术对转基因作物中常见的启动子、终止子和选择标记基因等多个外源基因进行检测，以建立一套快速、准确的转基因作物筛查鉴定技术．通过对大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测，并由常规PCR技术进行验证，证实基因芯片的检测结果准确可靠，并提高了检测效率，因此，可用于农作物转基因背景的鉴定．     

日本血吸虫体壁抗原基因的筛选与克隆

为筛选并克隆新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)候选抗原基因,以日本血吸虫成虫总DNA为模板,通过生物信息学以及分子生物学手段从日本血吸虫全基因组中筛选目的基因.根据所筛选到的目的基因的核酸序列设计合成引物,用PCR法扩增目的基因,将其克隆入pBS-T载体后转入到大肠杆菌DH5a菌株,筛选阳性克隆.通过对阳性菌落质粒进行PcR予以证实.最终成功筛选并克隆到日本血吸虫体壁候选抗原基因.     

绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．     

DNA purification and genetyping： Based on multifunc-tional nanobeads

In this report, a universal protocol for extract-ing genomie DNA from whole blood, saliva, and bacterialculture by using magnetic nanobeads as solid-phase absor-bents was presented. The enrichment of target cells and ad-sorption of DNA have been functionally integrated onto thesurfaces of the earboxyl-modified magnetic nano-beads, andthe DNA segments bound on the surface of the beads can bedirectly used as PCR templates to amplify a target geue. ThePCR products were applied to an oligonueleotide array toperform gene typing. The protocol proves to be simple, rapid,biologically and chemically nonhazardous, and promising forthe mierofabrieation of DNA preparation chip.     

大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测

采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.     

毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

Regulatory effect of cotton leaf curl virus AC2 on virion sense promoter

The AC2 gene of cotton leaf curl virus (CLCuV) was obtained by polymerase chain reaction (PCR) . The total DNA of the CLCuV infected tomato leaves was used as template, and the amplified DNA fragment was inserted into a cloning vector. Transient expression vectors were constructed by inserting the AC2 gene into downstream region of CaMV 35S promoter. These constructs were delivered into tobacco and cotton leaf cells for transient expression by particle bombardment. The results indicated that the virion sense promoter was activated by AC2 and its activity increased remarkably. However, the activity of transactivated virion sense promoter was still lower than that of the complementary sense promoter. The expression pattern of transactivated virion sense promoter was similar to that of the complementary sense promoter, namely with high activity in both mesophyll and vascular tissues. The possibility of application of AC2 in plant genetic manipulation was also explored.     

Cre-lox重组系统介导转基因烟草中外源基因删除的研究

对Cre在转基因个体中介导的重组效率进行了研究。构建了含有Cre 基因(p35S-Cre)和 GUS 基因侧翼含同向loxP 位点的(loxP-p35S-GUS-loxP)两种植物表达载体。以共转化的技术将两种基因元件同时转化烟草得到转基因植株,根据对共转化植株GUS 基因的活性分析、分子检测、PCR检测及对重组后扩增DNA片段进行序列分析表明：Cre-loxP 重组系统在转基因烟草中能精确高效地介导转基因的删除,但也存在部分植株不能完全删除的现象。     

肝片吸虫抗原基因转基因苜蓿再生的研究

用直接转化法，将构建有肝片吸虫保护性抗原基因FH3的植物表达载体pBI121-FH3,导入感受态的根瘤农杆菌EHA105；以重组的根瘤农杆菌为介导，用叶盘法转化苜蓿外植体，筛选得到抗Kan转化外植体；抗性外植体通过诱导丛生芽和诱导生根，再生出完整植株，提出植株总DNA进行Southern blot，结果表明，FH3基因已经整合入苜蓿基因组中。