碱性脂肪酶产生菌--扩展青霉K40原生质体的制备和再生

采用 0 .6%纤维素酶加 0 .6%蜗牛酶的混合酶由扩展青霉 K4 0中获得大量的原生质体 ,并比较了菌龄、二硫苏糖醇 ( DTT)预处理方式、酶解时间、温度、 p H、培养基成分及稳定剂等因素对原生质体的形成和再生的作用 .选出制备原生质体的最适条件 :0 .6%纤维素酶 +0 .6%蜗牛酶 ,在 0 .6mol/L Na Cl+0 .3 %Ca Cl2 ,DTT预处理 0 .5h,菌龄为 1 9～ 2 0 h,p H 5.4 ,2 8℃酶解 3～ 3 .5h,原生质体产量可达 2 .3 6× 1 0 7个/ml,实现再生 ,再生率达 70 %～ 80 % .并对原生质体的释放和再生方式进行跟踪观察     

扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D（260）／D（280）值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带。根据扩展青霉所产碱性脂肪酶（Lip PE)N末端20个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3‘端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT－PCR技术和3‘－RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3‘非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用Clot Tech公司的SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS－PAGE检测结果表明,所表达的GST－Lip EP融合蛋白分子质量约为53ku;免疫印迹（Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC20718脂肪酶的基因。     

扩展青霉碱性脂肪酶的克隆、表达及表达产物的活性分析

以扩展青霉为出发菌株,用Biospin RNA Simply P试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出扩展青霉碱性脂肪酶结构基因.构建真核重组表达质粒pEL-pIC9,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达.重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了分子量约28ku的1条特异条带,用橄榄油检验板法和NaOH滴定法测其活性,酶活可达225U/mL.结果表明,扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中能高效表达为有脂肪酶活性的高活力酶.     

荨麻青霉(Penicillium urticae)原生质体的制备与再生

对荨麻青霉原生质体的高效制备以及再生方法进行了探索.结果显示荨麻青霉较为适合的原生质体制备及再生条件的组合:菌龄为28 ℃恒温下培养20～22 h,DTT预处理0.5 h,以7 mg/mL的纤维素酶,7 mg/mL蜗牛酶,5 mg/mL溶菌酶为混合酶,0.6 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂,28 ℃恒温酶解3.5 h,PDA高渗双层培养基再生.该组合制备原生质体形成量达到1.59×107～1.89×107/mL,其再生率达到16.24%～19.25%.     

扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉（Pen.expansum）WMC20718所产碱性脂肪酶经离心分离、硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤等步骤,其酶纯化了18.5倍,获得了比活性为4200U/mg的纯碱性脂肪酶,提取得率48.8%。纯化后的脂肪酶经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高效反相色谱（RP-HPLC）检测,分别达到了SDS-PAGE电泳纯和RP-HPLC色谱纯。经SDS-PAGE和Sephadex G-150凝胶过滤色谱,分别测得酶的相对分子质量为27500和28200,表明该酶以单体形式存在。N末端20个氨基酸残基序列测定的结果为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。该酶的最适作用温度为30℃,在35℃以下稳定,45℃处理30min仅残留30%酶活性;PH稳定范围在6.5-10.5之间,最适PH值为10.0。阴离子表面活性剂LAS对该酶活性的影响较大,而非离子表面活性剂AEO9对酶活性无影响。洗涤剂蛋白酶在规定的添加量范围内,对脂肪酶的活性影响较小。     

扩展青霉碱性脂肪酶的纯化及N-端氨基酸序列分析

扩展青霉PF898的发酵液经硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换柱、Sephadex G100凝胶过滤等步骤，其碱性脂肪酶的活性被纯化了79．3倍，回收率约15％，此活为76．9U／mg。纯化蛋白经SDS－PAGE和HPLC TSK－GEL G3000SW凝胶过滤分析显示其分子量约为28kDa。纯化蛋白经氨基酸序列测定仪分析表明，其N－端12个氨基酸的序列为：A－T－A－D－A－A－A－F－P－D－L－H。     

谷氨酸产生菌原生质体的制备和再生

6株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶不同组合处理,对其原生质体形成进行了比较,在最佳条件下,原生质体形成率可达95～100％。B9-15 菌株细胞形态特殊,表面呈凹陷状,仅在含1.5～2.0％甘氨酸的高渗培养液中就能形成原生质体,在加有壁制剂的丁二酸钠高渗培养基上,所试菌株的原生质体再生率从10.5％～61.8％,差异性较大。     

扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉 (Pen .expansum)WMC2 0 718所产碱性脂肪酶经离心分离、硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤等步骤 ,其酶纯化了 18.5倍 ,获得了比活性为 4 2 0 0U mg的纯碱性脂肪酶 ,提取得率 4 8.8%。纯化后的脂肪酶经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和高效反相色谱 (RP HPLC)检测 ,分别达到了SDS PAGE电泳纯和RP HPLC色谱纯。经SDS PAGE和SephadexG 15 0凝胶过滤色谱 ,分别测得酶的相对分子质量为 2 75 0 0和 2 82 0 0 ,表明该酶以单体形式存在。N末端 2 0个氨基酸残基序列测定的结果为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。该酶的最适作用温度为 30℃ ,在 35℃以下稳定 ,4 5℃处理 30min仅残留 30 %酶活性 ;pH稳定范围在 6 .5～ 10 .5之间 ,最适pH值为 10 .0。阴离子表面活性剂LAS对该酶活性的影响较大 ,而非离子表面活性剂AEO9对酶活性无影响。洗涤剂蛋白酶在规定的添加量范围内 ,对脂肪酶的活性影响较小。     

扩展青霉FS1884脂肪酶基因的定点诱变及其活性分析

为提高扩展青霉FS1884脂肪酶活性,采用一步突变法对脂肪酶(PEL)的基因进行体外M220V定点诱变,然后将其连接到表达载体pPIC3.5K中, 构建重组表达载体pPIC3.5K-M220V-PEL,电转化毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导后脂肪酶成功分泌表达.重组脂肪酶的活性分析表明:突变体在毕赤酵母中得到活性表达,获得脂肪酶表达产物PEL-M220V-GS,在35 ℃下具有最高酶活为3 099 U/mg, 比野生型提高了5%.     

圆弧青霉突变株HB01碱性脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉(Peniciuium cyclopium)突变株可产生一种具有工业价值的碱性脂肪酶(alkaline lipase,PEL),通过RT-PCR基因克隆及序列测定,获得了PEL完整的基因序列,该基因全长855bp,编码1个由285个氨基酸残基组成的酶蛋白,根据氨基酸组成推导该脂肪酶蛋白的分子量约为30kD.     

衣康酸产生菌-土曲霉T-730原生质体的制备和再生

以衣康酸产生菌土曲霉T-730为供试菌株,研究了菌丝体培养方式、酶配比、菌丝的菌龄、酶解温度和时间、再生培养方法等因素对土曲霉原生质体形成和再生的影响．结果表明：采用液体静置培养12h～14h的菌丝体,在含有纤维素酶0．6％,蜗牛酶0．3%,溶菌酶0．1％的混合酶系统中,置35℃酶解3.5h,原生质体形成率最高;采用双层平板培养法于32℃再生,再生率达到70.6%     

斜卧青霉Penicillium decumbens原生质体的形成和再生因素的研究

用脱壁酶(含0.04％的蜗牛酶和0.5％的纤维素酶)以0.6M的(NH_4)_2SO_4作稳定剂,于pH6.5,35℃直接酶解不经任何预处理的培养22～25小时和33～36小时的斜卧青霉JN15、Jul的菌丝体,得到大量具再生能力的原生质体。用不同浓度的脱壁酶处理指数生长期的菌丝体,在本试验范围内,原生质体的形成量随酶浓度的增高而增加,其再生频率随酶浓度的升高而下降;对两者的关系进行了讨论,并给出了获得大量具再生活性的原生质体的脱壁酶的浓度范围。同时,研究了温度,pH、渗透压稳定剂的浓度对原生质体形成和再生的作用;在相差显微镜下,详细观察了原生质体的释放过程、形态变化以及原生质体再生成正常茵丝的全过程。     

低温碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶培养基的优化

以橄榄油为唯一碳源,从渤海湾盐碱地被油污染的土样中分离筛选出1株产低温碱性脂肪酶菌株34.5,初步酶学性质研究表明,该菌所产脂肪酶的最适温度为25℃,最适pH为9.6.该菌的16S rDNA基因序列与伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)的同源性为99%.摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基为(g/L):淀粉10,黄豆饼粉20,玉米浆20,K2HPO41,聚乙烯醇大豆油乳化液20.其最高酶活为6.87 U/mL.     

绣球菌原生质体制备及再生条件的初步研究

为进一步改善绣球菌栽培特性、提高栽培产量,对绣球菌原生质体制备与再生条件进行了初步探索.以绣球菌原生质体再生量为指标,对等渗剂、酶反应温度、pH和反应时间等影响因素进行了优化.结果表明,采用2%的溶壁酶溶解绣球菌菌丝细胞壁,制备原生质体的最佳条件是,以0.6 mol/L蔗糖为等渗剂,在30℃、pH值6.0环境下反应3 h.在此条件下,原生质体的再生量为11 850个/mL.     

扩展青霉TS414脂肪酶的克隆与原核表达

提取了扩展青霉Penicillium expansumTS414菌体的总RNA,并以反转录得到的cDNA为模板,成功扩增得到了脂肪酶基因;在此基础上,构建了重组表达载体pGEX-4T-1-PEL,并在大肠杆菌DH5α中实现了扩展青霉脂肪酶的表达;进一步采用低IPTG诱导浓度、低温、长时间的发酵策略等,使扩展青霉脂肪酶得以有活性的表达;同时,通过反复冻融细胞破碎法使其较好地从菌体细胞中分离出来,提取得到的酶液的活力达到0.49 U/mL。以上结果为后续脂肪酶分子进化等研究奠定了坚实的基础,亦可转化为高校或中学生物学实验教学的项目。     

新西兰青霉(Penicillium novae-zeelandiae)原生质体的制备与再生研究

利用酶对新西兰青霉菌的菌丝进行酶解获得原生质体,探究了影响原生质体制备和再生的因素,包括酶种类,酶浓度,菌丝培养时间,酶解时间和温度,pH,二硫苏糖醇(DTT)预处理等.结果显示最佳酶解条件为:菌丝体培养48h,用0.05mol·L~(-1) DTT预处理0.5h,以0.8mol·L~(-1)氯化钠作为稳定剂,31℃条件下经Lywallzyme(10mg·mL~(-1))酶解4h,原生质体数量达到4.75×107 g~(-1),再生率为18.0%.     

扩展青霉（Penicilliumexpansum）PF868脂肪酶的纯化 …

扩展青霉（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）ＰＦ８６８所脂肪酶通过硫酸铵沉淀纤维素柱层析以及Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ２００柱层析等步骤被纯化了７４倍。最终比活力为６９．７ｕ／ｍｇ。纯化后的脂肪酶经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯和微内径高效液相色谱纯。分子量经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ确定为２８．４４ＫＤ。脂肪酶Ｎ－端氨基酸序列测定的结果是：ＡＴＡＤＡＡＡＡＦＰＤ－这与其他一些真菌产的脂肪酶的序列具有国闫的同源性。     

碱性脂肪酶的发酵及提取工艺

对圆弧青霉ＰＧ３７发酵产酶工艺及脂肪酶提取工艺等进行了系统的研究。实验结果表明,２０ｍ３发酵罐在通风量为０．３～０．８Ｖ／Ｖ／ｍｉｎ、搅拌转速为１８０ｒ／ｍｉｎ、发酵温度为２８℃、培养过程中流加棉籽油以控制发酵醪ｐＨ值为６．５～７．０的条件下,发酵８４ｈ左右,成熟发酵醪酶活为４５２０Ｕ／ｍＬ。发酵液经过滤、超滤浓缩、硫铵沉淀、造粒等过程制得颗粒碱性脂肪酶成品,酶的提取总收率在７０％以上,颗粒酶活力单位为５．０×１０４Ｕ／ｇ。     

碱性脂肪酶产生菌的诱变及产酶条件的研究

微生物脂肪酶 ( E.C.3.1 .1 .3)是一种重要的工业水解酶 ,它可降解甘油三酯为甘油二酯、单甘酯和脂肪酸 [1 ] .碱性脂肪酶是洗涤剂用酶制剂中的一种 ,它可分解衣物上天然污垢中较难除去的甘油三酯 ,提高洗涤剂的去污能力 ,降低表面活性剂和三聚磷酸盐的用量 [2 ] .这里我们报道产碱性脂肪酶菌株的诱变及产酶条件优化等方面的研究结果 .1　材料和方法1 .1　材料1 .1 .1　菌种　芽孢杆菌 O6 2 6 ,筛选自青白江炼油厂的土壤中 .1 .1 .1　培养基　初筛培养基 ( g/L ) :上层　牛肉膏 3,蛋白胨 1 0 ,K2 HPO40 .5 ,Mg SO4.7H2 O0 .5 ,Na NO3…