猪淋巴细胞白细胞介素-6(PIL-6)基因的克隆和序列分析

将猪外周血淋巴细胞进行体外培养，在Con A的刺激下培养48h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT－PCR扩增猪淋巴细胞白细胞介素－6基因（PIL－6），并克隆到pUC18载体测序。结果发现，PIL－6的cDNA长度为741bp，开放阅读框为636bp，编码212个氨基酸，分子量24kD，等电点5.5；其46－129bp编码PIL－6的信号肽序列，130－681编码PIL－6成熟肽的序列。     

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究

以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.     

人和小鼠白细胞介素-5重组蛋白疫苗的提取

利用PCR技术从含有人和小鼠IL-5基因的质粒pORF9-hIL-5和pORF9-mIL-5质粒中扩增出人和小鼠IL-5基因序列,然后利用基因工程技术将人和小鼠IL-5基因序列分别插入原核表达质粒pQE30,获得人和小鼠IL-5重组表达质粒pQE-hIL-5和pQE-mIL-5.用酶切和DNA序列测定方法证实pQE-hIL-5和pQE-mIL-5正确后,转化感受态大肠杆菌JM109.用IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果表明:琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的人和小鼠IL-5基因序列相对分子质量大小和预期值一致,酶切pQE-hIL-5和pQE-mIL-5片段和预期值相符,DNA序列测定插入的人和小鼠IL-5 PCR产物基因序列和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白相对分子质量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达93%以上,抗组氨酸抗体可特异性识别hIL-5和mIL-5重组蛋白.     

子宫内膜异位症大鼠子宫内膜白细胞介素-6 mRNA表达的变化

目的：探讨大鼠子宫内膜异位症（内异症）发生、发展过程中子宫内膜白细胞介素－6（IL－6）mRNA表达的变化。方法：利用大鼠内异症动物模型，采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，检测子宫内膜白细胞介素－6（IL－6）mRNA表达情况。结果：正常对照组，各时间点间2、4、6和8周）IL－6mRNA表达无显著性差异（P＞0．05）。内异症模型组，在成模后2、4、6和8周其在位、异位子宫内膜IL－6mRNA的表达呈增高趋势（P＜0．01）。结论：IL－6mRNA可能与内异症的进展有关。     

重组人白细胞介素6工程菌的表达和功能初探

自人外周血的mRNA中获得了白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)cDNA,基因被克隆并在大肠杆菌中表达,在20L发酵罐中每L发酵液可得60g湿菌体,IL-6的表达量约占大肠杆菌全蛋白的30%以上,占包含体蛋白的60%。纯化产物在长期,急性毒性和三致实验正常的基础上,用恒河猴的功能实验表明,在不制造血象降低模型的情况下,仍能明显增加血液中血小板和白细胞的数量。     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

哮喘患者肺泡巨噬细胞中IL-6mRNA表达的研究

应用逆转录酶链反应及索氏转移杂交技术分析过敏性支气管哮喘患者(激素治疗组9例,非激素治疗组12例)及正常对照组(10例)肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophages,AM)中白细胞介素一6(interleukin-6,IL-6)的mRNA表达。IL-6/β-actin比值表示。结果发现未用激素治疗的哮喘患者AM的IL-6/β-actin为0.66±0.32,显著高于正常对照者(0.34±0.13,P<0.01)及激素治疗组(0.41±0.15,P<0.05)。提示表达IL-6的AM在哮喘的发病机理中可能具有重要的作用,而皮质激素治疗哮喘的机制之一可能与其抑制AM表达及产生IL-6的能力有关。     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

麻疯树核糖体失活蛋白curcin基因的原核表达及其抗真菌活性的研究

通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达.然后通过纯化原核表达产物,得到纯化的curcin重组蛋白,并以纸片法进行体外抗菌活性检测,发现其具有较强抗真菌活性.     

人野生型p53基因的克隆及原核表达

利用RT PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段, 并将其克隆入原核表达载体pQE40中, 构建重组质粒pQE40-p53; 转化于E.coli M15宿主菌, 经IPTG诱导, 表达了N端融合6His的p53融合蛋白. 利用6His与Ni²⁺高亲合力结合的性质, 经镍柱纯化、 透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定, 结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.
     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

幽门螺杆菌粘附素基因的原核表达

目的：构建幽门螺杆菌粘附素（hpaA）基因的原核表达载体，并诱导表达。方法：用PCR扩增hpaA目的基因片段，克隆至pQE-30表达载体中，构建含目的基因的表达质粒pQE-hpaA，转化E．coli DH5α，经IPTG诱导表达蛋白HpaA；Western blot分析其免疫反应性。结果：经测序hpaA基因片段由783bp组成，可编码260氨基酸残基的多肽。经SDS—PAGE分析相对分子量（Mr）约为30000。可溶性表达占全菌的42％以上。Western blot分析能与Hp全菌抗血清反应。结论：成功构建了粘附素hpaA基因的原核表达载体并能高效表达，为研制Hp疫苗提供理论依据。     

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.     

盐藻rbcS基因克隆及其原核表达

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Ribulose1,5-bisphosphate carboxylase／oxygenase,E,C．4,1．1．39简称RuBisCO）是光合作用中的关键酶,作者应用RT-PCR技术从一种极其耐盐的生物-杜氏盐藻的总RNA中克隆RuBisCO的小亚基（rbcS）的cDNA,它的开放读码框为570bp,编码190个氨基酸,将此cDNA定向克隆于原核表达载体pET-30a（＋）中,构建重组质粒pET-rbcS,经IPTG诱导,在大肠杆菌株BL21中表达．SDS-PAGE电泳表明,rbcS融合蛋白分子量约为26kDa．     

哮喘患者肺泡巨噬细胞中IL－6mRNA表达的研究

应用逆转录酶链反应及索氏转移杂交技术分析过敏性支气管哮喘患者（激素治疗组９例，非激素治疗组１２例）及正常对照组（１０例）肺泡巨噬细胞（ａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ＡＭ）中白细胞介素一６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）的ｍＲＮＡ表达。ＩＬ－６／β－ａｃｔｉｎ比值表示。结果发现未用激素治疗的哮喘患者ＡＭ的ＩＬ－６／μ－ａｃｔｉｎ为０．６６±０．３２，显著高于正常对照者（０．３４±０．１３，Ｐ＜０．０１）及激素治疗组（０．４１±０．１５，Ｐ＜０．０５）。提示表达ＩＬ－６的ＡＭ在哮喘的发病机理中可能具有重要的作用，而皮质激素治疗哮喘的机制之一可能与其抑制ＡＭ表达及产生ＩＬ－６的能力有关。     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。