乳腺癌细胞株对TRAIL敏感性不同的分子机制

不同的乳腺癌细胞株对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的敏感性不同. 为了揭示其分子机制, 分别以对TRAIL敏感和不敏感的乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)为模型, 比较分析了这2株细胞对重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)的不同敏感性的分子机制. 首先使用不同的抑制剂分别阻断细胞内3条主要存活通路(PKCd, MAPK, PI3K)后, 研究细胞对rsTRAIL的敏感性, 结果表明, 阻断这3条存活通路, 都不影响MD-MB-231细胞对rsTRAIL的敏感性, 说明MD-MB-231细胞对rsTRAIL敏感与这3条存活通路无关; 以MEK1/2抑制剂阻断MAPK途径或以Ly294002阻断PI3K途径都不影响MCF-7细胞对rsTRAIL的敏感性; 但以PKCd抑制剂rottlerin抑制PKCd活性, 能显著促进rsTRAIL诱导的MCF-7细胞凋亡, 提示PKCd高表达可能是MCF-7细胞对rsTRAIL不敏感的重要原因. 应用RNA干扰技术抑制PKCd的表达, 确证PKCd高表达是MCF-7细胞对rsTRAIL不敏感的关键因素. 同时, 进一步证明 caspase-3 表达重建不能改变MCF-7 细胞中PKCd的总体表达水平, 说明凋亡执行蛋白酶caspase-3缺陷, 不是PKCd高表达的主要原因.     

重组可溶性TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡

在大肠杆菌系统中表达并纯化了3种不同长度的可溶性TRAIL,分别为sTRAIL（74－281）,sTRAIL(95－281）及sTRAIL(101－28）。细胞凋亡实验表明氨基酸101位前的序列对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的生物学功能具有抑制作用。sTRAIL（101－281）能在6h内诱导不同类型的肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞无毒性。不同类型的肿瘤细胞对TRAIL的敏感程度不同,一些敏感肿瘤细胞系中部分细胞对TRAIL具有抗性。根据实验结果提出抗性细胞中可能表达一种或多种半衰期短的、能抑制肿瘤细胞凋亡的蛋白的假说,并为探索将TRAIL开发成肿瘤治疗药物的可能性奠定了基础。     

人可溶性TRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性. 以衣藻叶绿体基因组的clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2为同源重组片段, 壮观霉素抗性基因为选择标记, 构建了编码TRAIL胞外区可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣藻叶绿体表达载体p64TRAIL, 通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中, 经壮观霉素抗性筛选, 获得了3个抗性衣藻转化子. 转化子经过抗性继代筛选后, 经PCR, Southern blot检测分析及暗培养, 证实sTRAIL编码区DNA已整合到衣藻叶绿体基因组中, Western blot检测分析表明, sTRAIL编码区在衣藻叶绿体中获得了表达. Western blot影像摄录分析表明, 表达的sTRAIL蛋白占衣藻细胞可溶性总蛋白的0.43%~0.67%. 实验结果证明, 用衣藻叶绿体作为生物反应器生产医药蛋白是可行的.     

JWA参与调控细胞分化的结构和功能

为阐明新基因JWA的结构特征、表达调节规律和生物学功能,通过基因重组和测序,确定了大鼠JWA同源基因和人JWA基因621bp的启动子序列;用RT－PCR法,分析了培养细胞株和原代白血病细胞经药物处理后JWA mRNA的表达情况,发现TPA处理后JWAmRNA水平在肿瘤细胞株与非肿瘤细胞株中呈反向变化：用维甲酸治疗前的M3型白血病人骨髓白细胞,其JWA基因对多种诱导分化剂处理不敏感;而用维甲酸治疗10d后再用诱导分化剂处理,则JWA基因的转录水平均被下调,提示M3型白血病细胞在ATRA作用下的分化可能是启动JWA信号转导通路的前提。而JWA基因的表达下调是否为白血病细胞进一步分化及4HPR,As2O3和TPA等诱导细胞凋亡所必需,值得进一步探讨。JWA基因在不同种属中保持较为稳定的序列特征,说明该基因在生物进化中可能较保守并可能具有相近的生物学功能。     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.     

芹菜素通过抑制PKB/Akt激酶活性诱导人胃癌细胞凋亡

芹菜素是一种广泛分布于水果和蔬菜中的黄酮类物质. 研究证实, 芹菜素在体外可以抑制多种肿瘤细胞的生长, 但其发挥抗肿瘤作用的确切机制目前还不十分清楚. 采用人胃癌细胞株为肿瘤模型, 在体外探讨了芹菜素对胃癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用. 结果发现, 芹菜素可以明显抑制胃癌细胞的生长. 此外, 利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯形条带, Western blotting方法检测到Caspase-3的活性片段, 并呈现明显的时间依赖关系, 说明芹菜素可以诱导细胞发生凋亡. 进一步研究发现, 芹菜素在诱导细胞凋亡的同时可以抑制蛋白激酶B (Akt)的激酶活性. 芹菜素可以时间依赖方式抑制与细胞增殖相关的Akt及Akt下游促凋亡蛋白Bad的磷酸化, 但对总Akt及总Bad蛋白的表达无影响. 实验结果提示, 芹菜素可以通过抑制Akt激酶活性而诱导胃癌细胞发生凋亡. 由于已经证实在多种肿瘤细胞中存在Akt激酶的活化, 因此对肿瘤细胞中Akt激酶的抑制将为肿瘤的临床治疗提供新的思路.     

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.     

JWA参与调控细胞分化的结构和功能研究

为阐明新基因JWA的结构特征、表达调节规律和生物学功能,通过基因重组和测序,确定了大鼠JWA同源基因和人JWA基因621bp的启动子序列;用RT-PCR法,分析了培养细胞株和原代白血病细胞经药物处理后JWAmRNA的表达情况,发现TPA处理后JWAmRNA水平在肿瘤细胞株与非肿瘤细胞株中呈反向变化;用维甲酸治疗前的M3型白血病人骨髓白细胞,其JWA基因对多种诱导分化剂处理不敏感;而用维甲酸治疗10d后再用诱导分化剂处理,则JWA基因的转录水平均被下调,提示M3型白血病细胞在ATRA作用下的分化可能是启动JWA信号转导通路的前提,而JWA基因的表达下调是否为白血病细胞进一步分化及4HPR,As     

重组逆病毒介导的Immunocaspase-3分泌性T细胞对ErbB2阳性乳腺癌的杀伤作用

将Immunocaspase-3基因转染Jurkat T淋巴细胞, 使其稳定地分泌性表达靶向促凋亡蛋白Immunocaspase-3, 间接免疫荧光检测表明该蛋白可内化进入ErbB2阳性的SKBr3乳腺癌细胞, 细胞计数结果表明乳腺癌细胞的生长和增殖受到明显抑制. 进一步将Immunocaspase-3基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX, 转染PA317细胞进行包装, 挑选高滴度的包装细胞株收获病毒. 用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T淋巴细胞, 经筛选后通过尾静脉注射给荷有SKBr3乳腺癌的裸鼠, 观察到肿瘤生长明显受到抑制(抑制率 73.25%), 裸鼠存活时间较对照组延长80.95%. 免疫组织化学染色结果表明裸鼠肿瘤组织中有Immunocaspase-3蛋白分布, TUNEL检测证实肿瘤细胞发生凋亡. 上述结果表明, T淋巴细胞分泌的Immunocaspase-3在裸鼠体内可以识别和进入ErbB2阳性的乳腺癌细胞, 抑制肿瘤生长.     

天然抗癌细胞的发现

在“免疫监视”体组织的细胞的探索中,免疫学家已发现种类繁多的淋巴细胞,每一种具有特殊的功能。在正确的培养条件下某些类型的细胞可以杀死其他类型的的细胞(包括肿瘤细胞)。这些细胞包括T淋巴细胞子集和“天然”杀伤细胞。现代免疫学研究已揭示,淋巴细胞是通过释放出类似激素的物质(总称为淋巴激活素)来联系的,这种激活素可固着在细胞表面并“激活”细胞。一种熟知的淋巴激活素是由被抗原激活的T淋巴细胞释放出的间白细胞素-2(IL-2)。1980年美国国家癌症研究所的S.Rosenberg组注意到,当正常人或动物的淋巴细胞用IL-2培养时可获得杀死培养物中肿瘤细胞的能力。在84年完成的一系列实验中已表明,把淋巴激活素激活的杀伤细胞(LAK)注入肺部患转移瘤的小鼠,肿瘤即消失;将IL-2和LAK细胞同时注入亦同样有效。在新近的一系列实验中他们发现,如将IL-2注入     

v-fos转化效应因子是CD2胞内区新的结合蛋白

在以前的研究中, 本实验室采用酵母双杂交技术, 从人KT3 T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的新的蛋白分子, 称为v-fos转化效因子(v-fos transformation effector, Fte-1). 本研究进一步分析鉴定了Fte-1与CD2相互作用的分子机制和Fte-1的生物学功能. 应用研究生物大分子相互作用的生物传感器分析了CD2胞内区与Fte-1结合特性和亲和力, 表明二者确为特异性结合, 其解离常数K_D值为10^-7 mol/L; 分子缺失突变和体外磷酸化实验结果表明, Fte-1可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化, 其磷酸化位点为Ser238; 基因表达研究显示, 在Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中Fte-1呈簇集性分布; CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat T淋巴细胞后, Fte-1这种簇集性分布特征消失, 而趋向细胞膜, 并与 CD2共定位于细胞膜区域; Fte-1的PKC磷酸化位点Ser238突变为Gly238后, 其与CD2分子的共定位能力丧失, 表明Fte-1的Ser238的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合起关键作用; 使用Fte-1干扰RNA技术抑制Fte-1在Jurkat T淋巴细胞中的表达, 可抑制佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)引起的Jurkat T淋巴细胞激活后凋亡, 提示Fte-1参与了CD2对T淋巴细胞凋亡的调节. 上述结果进一步确证Fte-1是CD2胞内区的特异结合蛋白, 并可能参与了CD2介导的细胞凋亡信号传递.     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

天然“抗癌细胞”的发现

免疫学家在寻找体内起免疫监视作用的细胞时,发现了多种具有不同功能的淋巴细胞.如果培养条件适宜的话,有些类型的细胞会杀伤其他类型的细胞,包括肿瘤细胞.这些细胞包括T 淋巴细胞亚群和“自然”杀伤细胞,所以称为自然杀伤细胞是因为它从血液或者淋巴组织中分离出来时处于有活性的细胞毒(细胞杀伤)状态,而毋需活化或免疫措施.几种细胞毒细胞成功地起着免疫监视的作用,然而尽管这些细胞在培养中能杀伤一些肿瘤细胞,但是还未能证明它能在癌症患者中也有同样的效能.现在免疫监视再次引起了大家的重视,因为一种新的     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

光敏性单克隆抗体的制备及其细胞毒作用的观察

光敏化剂血卟啉(Hp)及其衍生物(HpD),近年来已作为新型抗肿瘤药物应用于临床,然而其对肿瘤组织的选择性作用不十分理想,对肿瘤周围及其它正常组织也有损伤。为增强其特异性改进杀伤肿瘤效果,我们选择抗人T淋巴细胞MCAB作为HP的特异载体,制备出MCAB-Hp的杂交分子,这种杂交分子兼备二者的特点,在体外对T细胞性白血病细胞有选择性杀伤,从而表明这类杂交分子在肿瘤治疗中的潜力。     

氨肽酶N基因启动子的克隆及在造血细胞和不同肿瘤细胞中的活性分析

从人外周血淋巴细胞中克隆了氨肽酶N基因（APN）的上游启动子并进行了序列分析。构建了含APN上游启动子和荧光酶报告基因的重组质粒pXP1-APNLuc,对骨髓母细胞和几种肿瘤细胞进行转染。分析结果表明APN止游启动子具有骨髓特异性,其在骨髓母细胞KG1a中活性最高,而在Jurkat细胞中活性很低。APN启动子在肺腺癌细胞中活性较高,在肝癌细胞中基本无活性,在舌癌细胞和食管癌细胞中活性明显降低。APN基因启动子的这一特点为在肿瘤患者实施化、放疗的同时,特异性地保护造血系统提供了新的思路。     

表达新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组禽痘病毒的构建及其抑瘤作用

来源于新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuramidinase, HN)蛋白不仅能够介导受体识别, 还具有水解这些受体中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NAcneu, 唾液酸)成分的神经氨酸酶(neuraminidase, NA)活性. 研究表明, HN蛋白可针对包括人类在内的哺乳动物产生抗肿瘤作用和免疫刺激作用. 为探索HN基因在肿瘤基因治疗中的应用, 构建了表达HN的重组禽痘病毒(vFV-HN), 并通过体内外实验比较了其与野生型禽痘病毒(FPV)的抗肿瘤作用. 实验结果表明, 虽然B16肿瘤细胞对FPV感染所致细胞毒作用具有一定耐受性, 但vFV-HN具有显著的抑瘤作用. 并且, 与FPV相比, vFV-HN免疫可显著延长荷瘤动物模型的生存期. 另外, vFV-HN免疫可刺激产生B16肿瘤细胞特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和促进CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞的增殖. 研究还发现, vFV-HN免疫可刺激小鼠分泌IL-2和IFN-g等Th1类细胞因子, 说明vFV-HN的抑瘤作用与Th1类免疫反应相关. 实验结果提示, vFV-HN免疫具有潜在的肿瘤基因治疗研究价值.     

小鼠胸腺基质细胞诱导早期T细胞株分化的研究

利用１１株处于ＣＤ３＾－ＣＤ４＾－ＣＤ８＾－阶段的病毒转化早期Ｔ细胞株Ｃ３２０研究了体外胞腺基质细胞系对早期Ｔ细胞ＴＣＲ－ＣＤ３复合体表达的诱导作用，并对参与此作用的细胞表面信号分子进行初步鉴定。结果表明：在体外胸腺基质细胞系通过与Ｃ３２０细胞－细胞间相互作用，诱导其表面ＴＣＲ－ＣＤ３分子的表达。进一步的研究表明，对ＴＣＲ的诱导主要作用于其转录后阶段；对ＣＤ３的诱导涉及转录前后两个阶段，单抗阻断实     

腺病毒介导的CTLA4-FasL基因转移预防小鼠自身免疫性糖尿病

抑制或删除自身免疫性T细胞对胰岛素生成细胞——β细胞的破坏可以有效预防1型糖尿病的发生. 研究表明CTLA4-FasL双功能免疫抑制分子可以抑制T细胞活化及促进T细胞的凋亡. 在多次小剂量(40 mg/kg)腹腔注射链脲佐菌素诱导的小鼠自身免疫性糖尿病模型中, 初次给予链脲佐菌素的同时, 经尾静脉输注(2 ~ 5)×10⁸ pfu/mL CTLA4-FasL腺病毒进行基因治疗后, 糖尿病的发病率显著降低(13%, n = 15), 血糖和胰岛素水平维持正常; 且显著诱导胰腺淋巴细胞凋亡及胰腺淋巴细胞IFN-γ与Vβ8.2 TCR的mRNA表达明显下降. 表明腺病毒介导CTLA4-FasL基因治疗, 有效诱导自身反应性T细胞凋亡, 提示其在预防自身免疫性糖尿病的潜在价值.     

PI3K/Akt信号传递途径与CD3ε介导T淋巴细胞激活和凋亡的调控

利用Western 印迹免疫沉淀及激酶活性测定方法, 研究表达CD8a胞外区-跨膜区和CD3ε胞浆区的融合分子(CD8ε)的Jurkat T淋巴细胞激活与凋亡过程中磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB或Akt)表达及酶活性的变化. 结果表明, 在抗CD8单抗诱导的CD8ε Jurkat T淋巴细胞(TJK)激活与凋亡过程中, PI3K及Akt的表达均明显增加, Akt的激酶活性也增加. 而将CD8ε- ITAM中的一个酪氨酸(Y170)突变为苯丙氨酸(Y170F)并在CD8-细胞中表达(T1JK)后, 经CD8单抗刺激未发生细胞凋亡, 而且PI3K和Akt的表达水平及Akt的激酶活性也无明显变化, 表明PI3K及Akt参与了抗体诱导的T淋巴细胞激活与凋亡过程.