蛹虫草纤溶酶液体发酵条件的优化

在发现蛹虫草具有纤溶酶活性的基础上,对蛹虫草产纤溶酶的液体发酵条件进行了优化,以期获得最佳的产酶条件。研究结果表明,蛹虫草纤溶酶的最优培养基组成是：以20 g/L可溶性淀粉为碳源,10 g/L酵母粉为氮源,Mg2＋浓度为7 mmol/L;最适发酵初始pH值为6;最适发酵时间为4 d。     

华根霉固态发酵产纤溶酶的工艺优化和初步提纯

采用华根霉TK317（Rhizopus chinensis）进行固态放大发酵实验，发酵培养基初始含水量为0．75mL／g，固体发酵罐中湿度控制在70％，发酵前期30h通风量为640L／min，后30h通风量变为560L／min，酶活力最高，达到706．3U／g干基。研究并确定了中空纤维超滤浓缩，硫酸铵盐析的分离提取工艺，经过纯化，酶的比活力达23．32U／mg，比浸提液提高11．05倍，酶活力回收率为70．2％。     

产纤溶酶菌株的发酵条件优化

筛选了1株产纤溶酶能力较强的芽孢杆菌,对其液体发酵条件进行了优化,结果表明菌株产酶最佳的各组分质量浓度为木糖20 g/L,大豆蛋白胨30 g/L,Na2HPO41 g/L,MgSO41 g/L,CaCl20.1 g/L,吐温40为2 g/L.种龄16 h,接种量3%,发酵周期3 d,起始pH为7.0,摇床转速200 r/min,发酵温度37℃,在此条件下发酵液纤溶酶活性(相当尿激酶活力单位)高达862.2 U/mL.     

中国传统发酵食品中溶栓酶活性检测方法比较

通过正交实验设计建立最佳琼脂糖-纤维蛋白平板法,并比较改进的纤维蛋白平板法和四肽底物法测定中国传统发酵食品中溶栓酶的活力的线性和精密度,以找出一个灵敏易操作、经济实惠、快速准确地标示溶栓酶效价的活性检测方法。实验结果显示纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在50～800IU.mL-1、0.03～2.60U.mL-1范围内具有良好的线性关系,且日间和日内变异系数均小于6%。因此,纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于溶栓酶的活性检测,前者测定结果比较直观,但四肽底物法操作比较简单,经济成本相对较低,灵敏度高,更适合溶栓菌株的高通量筛选。     

蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株纤溶酶的酶学性质

对蜡状芽孢杆菌Bc-05茵株的发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析所获得的纤溶酶进行性质研究.结果表明:经纤维蛋白平板法检测该酶有直接水解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用,最适作用温度37℃,最适pH=8.0,在pH=8.0条件下25℃和37℃放置24 h酶活力仍保持77.52%和78.96%,该酶体外对兔血凝块有明显的溶解作用;Ca2+,Mn2+离子对该酶具有激活作用,而Cu2+,Fe3+完全抑制其纤溶活性,PMSF,EDTA和DTT对该酶有抑制作用,说明活性中心含有二硫键、金属离子和丝氨酸;测其N端10个氨基酸序列为NH2-Val-Thr-Pro-Thr-Asn-Ala-Val-Asn-Thr-Gly,与其他生物来源的纤溶酶相比较没有同源性.     

木聚糖酶生产菌黑曲霉的诱变及周期变压发酵

木聚糖酶产生菌黑曲霉An-1经紫外线和硫酸二乙酯(DES)处理后,采用显色平皿法及液体培养筛选,得到一产木聚糖酶活力较高的菌株An-1.15,其产酶能力比An-1提高90%。同时研究了周期变压操作对固态发酵过程中黑曲霉产酶的影响。当变压范围为0～0.15MPa,选取适当变压周期时,黑曲霉木聚糖酶酶活以干料计高达3690IU·g^-1,比静止固态发酵高38%。     

纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件的研究

目的：从三峡地区丘陵地带采集样品中分离以稻草秸秆粉为碳源的产纤维素酶菌株．方法：以刚果红为显色剂,采用CMC—Na固体培养基初步筛选产酶的微生物,然后将透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株分离纯化后,进行摇瓶复筛,最后经过单因素实验和正交实验优化该茵珠的产酶条件．结果：分离得到一株产纤维素酶活力较高的菌株（X3）,经初步鉴定其为曲霉属,该菌株产纤维素酶的最佳条件为：培养温度28℃、培养时间72h、初始pH值6、装量为15mL／250mL三角瓶．在此条件下FPA酶活为2．413IU／mL、CMC酶活为2．406IU／mI—J3一葡萄糖苷酶活为10．633IU／mL,分别是菌株X3初始酶活的l_04倍、2．20倍和1．19倍．结论：通过产酶条件优化后,菌株X3各酶活分别提高．     

产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体产酶特点分析

通过对实验室分离筛选出的2株产纤溶酶能力较强的细菌菌株进行16S rRNA碱基序列测定,并与已发表的16S rRNA序列进行对比分析,确定2个菌株均属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).在此基础上,对2个菌株液体发酵产纤溶酶的特点进行了对比分析.实验结果表明,2个菌株适宜的发酵产酶时间均为60～108 h.在优化的液体发酵条件下,2个菌株单位发酵液中纤溶酶平均产量可分别达到773.07 U/mL(菌株1)和962.28 U/mL(菌株2).     

蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。     

利用稻草液体发酵产纤维素酶及酶粉提取的研究

利用摇瓶确定的优化培养基配方和产酶条件,在30 L罐中研究了里氏木霉HC-415菌利用稻草液体发酵产纤维素酶发酵液pH值、纤维素酶活性等随时间变化的动态规律,研究了发酵液纤维素酶的提取及得率等.所得未脱盐冻干纤维素酶粉CMC酶活性平均为355.0 IU/g,FPA平均为44.3 IU/g.相对发酵液得率平均为16.00...     

豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究

通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

纳豆激酶是从日本传统食品内豆中提取出来的一种具有溶血栓功能的酶。笔者从市售纳豆中分离出一株能产纳豆激酶的菌株,并对之进行液体培养,发现在ｐＨ７．０,接种量为２％,种龄２４ｈ,装液量１０ｍＬ／１００ｍＬ,碳源为木糖,浓度为２％,氮源为大豆蛋白胨,浓度为３％的条件下,接种后第四天为产酶高峰期,最高产酶量可达到７８７．１尿激酶单位／ｍＬ发酵液。     

产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化

为了获得纯纤溶酶并探讨其酶学性质,从广泛收集的豆豉中筛选到一株具有高产纤溶酶能力的菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌.将该菌突变株DC-12N8的发酵液经离心除菌、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤,获得电泳纯的豆豉纤溶酶,每升发酵液可得到4.5mg活性酶蛋白,每克酶蛋白活力达1.18mol/s,纯度为发酵原液的53.6倍,回收率为11.7%.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,该酶是单链蛋白质,其分子质量约为28ku.     

响应面法优化Anoxybacillus sp.YIM 342产耐高温α-淀粉酶发酵条件

 利用响应面法对Anoxybacillus sp.YIM 342产耐高温α-淀粉酶的液体发酵培养条件进行优化.在单因素试验的基础上,首先应用Plackett-Burman实验设计筛选在发酵过程中对产酶量影响较大的因素,然后利用中心组合设计确定对产酶量影响较大因素的最佳水平.筛选结果表明,淀粉和CaCl₂ 的浓度以及发酵时间对产酶量有显著的影响;最佳发酵条件为:淀粉11.73 g/L,CaCl₂ 0.65 g/L,发酵时间为37.27 h,胰蛋白胨5 g/L,MgSO₄ 0.5 g/L,起始pH值6.5,转速200 r/min,温度55℃,在此条件下产酶量达到了62.71 U/mL,较初始产酶量提高了3.25倍.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质鉴定

以赤子爱胜蚓为材料，经过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤和制备电泳分离得到四种纤溶酶组分．经PAGE鉴定四种组分为单一组分；SDS-PAGE测定其分子质量分别为27、28、23和33ku；等电点均在4．0以下；经甲苯胺蓝染色后都出现糖蛋白的阳性反应；用苯酚一硫酸法测定其中性糖含量分别为8.4％、13.5％、9．1％、6．8％；纤维平板法测得四种组分的活性存在明显差异；四种组分都具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用．pH值对四种组分纤溶活性稳定性的影响各不相同．四种组分对温度的适应范围较广．     

利用柚皮高效发酵生产柚苷酶的研究

以棘孢曲霉为菌种,以磷酸氢二铵为氮源固态发酵柚皮生产柚苷酶,结果表明,在以柚皮为碳源和磷酸氢二铵为氮源的发酵体系中,添加疏松剂和豆饼粉对柚苷酶发酵没有显著影响,而磷酸氢二铵添加量和水分质量分数对柚苷酶合成具有显著影响.当无水柚皮粉中磷酸氢二铵和水分质量分数分别为32.4%和170.0%时,有利于提高柚苷酶发酵活力.在接种量为7.1%、发酵温度为30 ℃的情况下发酵6 d,柚苷酶比合成速率与棘孢曲霉的生长速率符合模型Y柚苷酶=6.2677 X-0.0381,其中Y代表柚苷酶的比合成速率,X代表比生长速率.用Davis法测得柚苷酶活力为94.61 IU/g,酶发酵的培养基成本（5×10-5元/IU）远远低于其他同类研究,酶的纯度远高于用豆饼粉为氮源所获得的酶纯度.     

壳聚糖固定化蚯蚓纤溶酶及其性质

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联荆,用吸附交联法固定蚯蚓纤溶酶,对蚯蚓纤溶酶的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究,确定了酶固定的最适条件:1 g用pH为6.5的磷酸盐缓冲液浸泡的壳聚糖载体与5 mL体积分数为1%戊二醛在25℃交联8 h,充分洗去戊二醛之后,加入蚯蚓纤溶酶13 U,4℃吸附6 h,充分洗去未交联的游离酶,酶活力回收最高大约为63%,固定化酶的比活为0.082 U/mg.固定化酶,游离酶的最适温度均为50℃,游离酶的最适pH值为8.5,而固定化酶的最适pH值为8.0,固定化酶的热稳定性,pH稳定性均比游离酶有所提高,游离酶、固定化酶都能水解纤维蛋白原和纤维蛋白,固定化酶不再水解BSA.     

碱性脂肪酶的发酵及提取工艺

对圆弧青霉ＰＧ３７发酵产酶工艺及脂肪酶提取工艺等进行了系统的研究。实验结果表明,２０ｍ３发酵罐在通风量为０．３～０．８Ｖ／Ｖ／ｍｉｎ、搅拌转速为１８０ｒ／ｍｉｎ、发酵温度为２８℃、培养过程中流加棉籽油以控制发酵醪ｐＨ值为６．５～７．０的条件下,发酵８４ｈ左右,成熟发酵醪酶活为４５２０Ｕ／ｍＬ。发酵液经过滤、超滤浓缩、硫铵沉淀、造粒等过程制得颗粒碱性脂肪酶成品,酶的提取总收率在７０％以上,颗粒酶活力单位为５．０×１０４Ｕ／ｇ。     

一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

以针对人活化血小板表面糖蛋白GMP140的单克隆抗体SZ51的单链抗体作为导向分子,以单链尿激酶32kd变体(scu-PA-32k)作为效应分子,构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应(PCR),分别从SZ51的Fab片段基因中扩增出V_K和V_H区;从尿激酶原基因中扩增出scu-PA-32k基因。通过合适的linker及酶切位点,将V_K, V_H及scu-PA-32k基因相连接并装入表达载体pET-5a中的Nde I位点,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达了重组蛋白。Western-Blotting检测到在8mol/L尿素存在下,该重组蛋白与抗尿激酶的多克隆抗体之间仍有弱的结合反应。表达产物经变复性处理和部分分离纯化后,在纤维蛋白平板上表现有较好的纤溶活性,且这种活性是通过激活纤维蛋白溶酶原为纤溶酶而实现的。重组蛋白纤溶活性的比活达到17500IU/mg,较好地保留了尿激酶的纤溶活性,重组蛋白的产率约每100g湿菌为1.5mg。     

噬菌体单链抗体导向溶栓剂的构建

Fibrin\|specific antibodies were isolated from a phage\|displayed single\|chain antibody(ScAb) library using affinity selection or panning.DNA shuffling was introduced to realign the specific antibody genes in order to mimic the antibody maturation in vivo. After cloning of shuffling products,a secondary library was constructed,from which the specific antibody against fibrin with higher activity was selected through panning and screening.The fibrin\|specific antibody gene and uPA functional domain gene fragment were joined together,then inserted into expression plasmid pET\|21a.The ScAb/uPA fusion protein was expressed with the induction of IPTG.In substrate S 2444 assay,the uPA activity of the chimera was about 3.1×10 3?IU/mg periplasmic protein of host E.coli .It also kept up the affinity to fibrin.