高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建和对烟草的转化

将苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV-Ch)的复制酶P2亚基(90 kD蛋白)基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROKⅡ中，得到重组植物表达载体pAIMV-FL．用三亲融合法导入农杆菌LBA4404，并转化烟草，经PCR检测，获得了含全长cDNA的转基因烟草植抹．     

芸苔EPSPs基因cDNA的克隆和表达载体的构建

作者从芸苔(Brassica campestris)中用RT-PCR方法获得了EPSPs基因的cDNA．与其他物种中的EPSPs基因进行了比对和分析发现：芸苔EPSPs基因的cDNA与欧洲油菜的同源性最高,为93％,与水稻同源性最低,仅为64％．将芸苔EPSPs的ORF片段插入到GTK融合表达载体中,为EPSPs的原核表达奠定了基础。     

甜味蛋白thaumatin表达载体的构建

将克隆在不同质粒上的thaumatin基因的两个片段连接起来，连接产物克隆到质粒pUC18上．测序结果表明，连接产物是一个完整的thaumatin cDNA基因．将此基因通过基因重组技术，克隆到植物表达载体pBI121中，构建了一个新的转化植物的表达载体-pBIl21-tha.     

人补体调节蛋白基因MCP和DAF的克隆及其在E. coli中的表达

人膜辅基蛋白MCP(membrane cofactor protein)和降解加速因子DAF(decay-accelerating factor)是免疫排斥反应中补体系统活性调节的重要蛋白．以PCR的方法分别从成人肝cDNA文库和胎儿骨髓cDNA文库中扩增得到MCP和DAF基因，克隆入载体pUC19，再以所构建质粒为模板，以PCR的方式在二基因间加入编码柔性连接肽的DNA序列，构建融合基因MCP-DAF，并克隆入pUCl9质粒．将MCP、DAF及MCP-DAF亚克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )或pET-32b( )，构建表达载体MCP-pET32a，DAF-pET32b及MCP-DAF-pET32a，分别导入E．coli BL21菌株中表达，得到预期分子质量大小的蛋白．     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)和绿头野鸭(Anas platyrhynchos)卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA(同源性为96%)、褐家鼠睾丸cDNA(同源性为83%)有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

人野生型抑癌基因PTEN的逆转录PCR法克隆及序列分析

以正常人胎盘组织总RNA为模板，通过优化引物和PCR条件，采用逆转录PCR法扩增出人野生型PTEN基因cDNA片段，并克隆到pMD18-T载体，获得重组子pMD-PTEN．序列分析表明，该cDNA长1212 bp，与GenBank中PTEN基因序列相比有3个碱基发生了变化，但全部为同义突变，证实获得了人野生型抑癌基因PTEN的cDNA克隆，为进一步构建原核表达载体及研究PTEN蛋白的抑癌效果、抑癌机理打下基础．     

牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建

肠激酶(Enterokinase,EK)是目前生物制药领域纯化重组蛋白产品时用于切割融合蛋白的首选工具酶之一．为克隆表达牛肠激酶催化亚基(EKL)编码的基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售肉牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCm-T载体中进行全序列分析．结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致．随后,将目的基因片段插入pET32a融合型表达载体中．经测序证实其重组DNA5’端多克隆位点与重组片段的接口处核苷酸顺序准确无误,所表达重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量为50kD,表达量达38％,为进一步进行Enterokinase催化亚基蛋白表达及活性研究奠定了基础．     

青岛文昌鱼神经胚中期cDNA文库的构建

提取青岛文昌鱼18小时神经胚中期mRNA,以5＇脱磷的NotI-oligo(dT)18为引物,反转录合成cDNA.双链cDNA的5＇端钝端连接上带EcoRI突出末端的衔接头,再经NotI酶切,在cDNA的3＇端形成NotI突出末端.以SizeSep离心层析柱除去400bp以下的小分子,与带有NotI和EcoRI突出末端并经过5＇端脱磷的λExCellNotI/EcoRI/CIP载体DNA进行连接,经体外包装和感染NM522宿主菌,得到了3.6×10     

大鼠20αHSD基因调控序列的克隆与检测

酶切包含20αHSD基因及其调控序列的X噬菌体13NA,获得4．0kb的DNA大片段,将此片段与载体质粒连接得到重组质粒,酶切重组质粒后电泳,再以地高辛标记的20αHSD基因的cDNA为探针进行Southern杂交,实验获得了大片段的重组质粒。     

一个新的水稻GST类似蛋白基因XIG的克隆与分析

根据编码一种玉米GST类似蛋白的mRNA In2-1序列设计引物，以水稻cDNA文库为模板，PCR扩增得到一条270bp的DNA片段，以此片段为探针分别筛选水稻根cDNA文库及水稻基因文库，获得一条全长cDNA及其相应的全长基因，并通过测序得到了两者的全序列，该基因编码的蛋白具有GST的典型特征，在水稻中尚未见报道。     

黑线仓鼠AVP基因部分序列的系统进化及结构分析

根据GenBank中黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）同源物种的AVPcDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术得到了黑线仓鼠精氨酸加压素（AVP）基因部分cDNA序列,包括外显子2的全部序列和外显子1、3的部分序列,共433bp,并注册到GenBank（登录号：JN227681）。该段序列共编码143个氨基酸,二级结构预测显示片段中含较多的a螺旋。该序列与其他物种相应区域的比较结果表明其同源性为84％～92％,氨基酸序列同源性为82％-93％。系统进化分析结果与物种亲缘关系的远近一致,该序列的克隆为研究AVP的表达调控机制奠定了基础,将有助于AVP的作用机制的研究及功能分析,同时该cDNA序列可作为物种亲缘关系或遗传距离研究的理想标记。     

用cDNA-AFLP银染技术研究与花椰菜花色相关的基因

将smart cDNA PCR和AFLP银染技术结合，建立了一种新的mRNA差别显示技术，用这种方法对花椰菜黄花和白花的两个近等基因系进行了研究，找到一条差异带，经过Northern点杂交检测，发现此带为白花株系特有的谱带。     

拟穴青蟹PDI保守区域的克隆与序列分析

蛋白二硫键异构酶(PDI)是真核生物重要的多功能蛋白,其基因结构在虾蟹类尚未报道.从拟穴青蟹Scylla pa-ramamosain(Estampador,1949)脑组织中分离纯化总RNA,经逆转录得到cDNA第一条链,并以之为模板利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术,扩增出一条950 bp的cDNA.将所得cDNA克隆到质粒载体pTZ57R/T,转化大肠杆菌DH5α细胞并对筛选的阳性克隆测序.通过与目前数据库中序列的比较,在此cDNA编码蛋白中发现其中101个氨基酸与其他物种已知蛋白二硫键异构酶(PDI)中的PDI_a_PDI_a'_C保守区域相似率在64%～79%之间.确定此cDNA编码拟穴青蟹PDI_a_PDI_a'_C保守区域.     

褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱羧酸酯酶基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为396 bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自铜绿蝇、家蝇、沟鼠、黑腹果蝇、线虫和埃及伊蚊的羧酸酯酶的片段存在高度同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,羧酸酯酶基因表达水平明显升高.以上结果表明,羧酸酯酶基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在有毒化学物质解毒及增强褐飞虱对抗性水稻的耐受性方面可能起着重要作用.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆及其序列分析

从病变鸡法氏囊组织中分离纯化IBDV,提取其基因组RNA.以IBDVRNA为模板,进行反转录反应合成cDNA第1链.采用PCR技术扩增VP5基因.将PCR产物经酶切后与pcDNA3.1(+)载体连接,经转化、筛选得到重组质粒pIBDV-VP5.对VP5基因进行了测序并对其序列进行了分析.     

人类Neuritin cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库筛选出一条1618bp的cDNA。此cDNA含有一个426bp的最大开放阅读框,编码一个142个氨基酸的蛋白质,预测分子质量为15.3ku。与目前数据库中序列比较,该cDNA与鼠neuritin基因同源性达98％。多组织Northern blot分析显示neuritin在脑组织高度表达。neuritin cDNA的读框片段正确插入到pQE40表达载体中,获得了预期的表达产物,并初步得到了其纯化蛋白。     

盐生杜氏藻Ugd基因的cDNA克隆及序列分析

作者对不同物种Ugd基因的同源序列进行相似性分析后设计一对兼并引物，利用RTPCR技术获得一条200bp左右的片段，测序分析显示其同芋头(Colocasia esculenta)的Ugd基因的编码区有71．7％的相似性．然后再以此片段为模板设计引物，通过RACE技术获得盐生杜氏藻Ugd基因的全长序列．经克隆测序作blastx分析发现其同芋头(Colocasia esculenta)、大豆(Soybean)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的Ugd基因有78％到81％的同源性．