葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ宁夏分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

用酶联免疫吸附法对宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种进行卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ)的测定,检测率为37.1%,与田间自然发病率调查结果基本一致.设计GLRaVⅢ外壳蛋白(CP)基因序列引物对,进行RT-PCR扩增,获得1.1 kb的特异片段.其中,CP基因长942 bp,推导的编码蛋白含有313个氨基酸.通过对GLRaVⅢCP基因同源性比较,结果表明,GLRaVⅢ宁夏分离物的CP基因与四川分离物SL-10 CP基因的亲缘关系最近,核苷酸和所编码的氨基酸序列同源性分别为98.8%和98.1%;与巴西分离物PET-4和智利分离物C1-817 CP基因亲缘关系较远,核苷酸序列同源性低于95.0%,所编码的氨基酸序列同源性低于97.0%,认为GLRaVⅢ株系间的CP基因存在差异.     

PRRSV福建流行毒株结构蛋白基因之克隆分析

对福建省流行的PRRS病毒FJ-1的结构蛋白基因进行了克隆、测序.FJ-1结构蛋白基因序列长3 188个核苷酸,包含7个开放阅读框(ORF).将FJ-1结构蛋白基因与国内外已发表的18个报道全长结构蛋白基因的PRRSV毒株进行核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较,发现:其与17个美洲型毒株核苷酸同源性达到89.7%～92.4%,推定各个ORF编码氨基酸的同源性在85.6%～98.6%之间;而与欧洲型毒株Lelystad核苷酸同源性为54.9%,推定各个ORF编码氨基酸同源性为53.2%～78.2%.遗传进化树分析表明FJ-1与美洲型毒株进化距离近,而与欧洲型毒株进化距离远.从分子水平上证明了福建省流行的PRRS病毒属于美洲型毒株.     

大腹圆蛛拖丝蛋白基因3'端克隆和序列分析

用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从大腹圆蛛主壶腹腺组织的基因组DNA和RNA中分别扩增获得编码拖丝蛋白基因的3'端基因序列,克隆PCR产物到pDrive载体,经PCR、限制性酶切筛选和序列分析后证明获得了蜘蛛拖丝蛋白基因两个克隆AvDS1和AvRS2.基因序列和氨基酸序列分析表明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋白基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋 基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvD     

山羊奇异变形杆菌毒力因子zapA基因的克隆及蛋白结构预测

为了研究山羊奇异变形杆菌毒力因子,克隆zapA基因和预测推导的蛋白结构.采用PCR方法,对山羊奇异变形杆菌zapA基因进行扩增、克隆及序列测定;利用生物信息学软件预测推导zapA蛋白的信号肽、跨膜区、二级结构及B细胞抗原表位.结果表明:zapA基因长为1 476bp,编码491个氨基酸,与参考株的核苷酸序列同源性为99.59%,氨基酸同源性为99.59%;zapA蛋白存在信号肽,无跨膜区,B细胞表位可能位于69-71,78-84,136-139,197-199,353-356,371-373和472-474氨基酸区域内或附近.该试验为奇异变形杆菌zapA蛋白的表达及基因工程疫苗的研制提供了理论基础.     

H5N1亚型禽流感病毒M基因的克隆与分子进化分析

以一株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增M基因全长,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,测序结果表明所克隆的982个核苷酸的片段包含了M1和M2基因的完整阅读框架,通过软件推导M1和M2基因分别编码252和97个氨基酸,将M全长序列与Genbank收录的10株H5N1亚型流感病毒M基因序列进行比较,病毒株之间M基因核苷酸序列同源性为92.3%～99.3%,编码的两个蛋白M1和M2氨基酸序列间同源性分别为为96.0%～98.8%和92.9%～99%,分子进化分析揭示了病毒株间的亲源关系.     

芜菁花叶病毒四川分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

从四川省3个蔬菜基地感病的甘蓝、花菜、萝卜、叶芥菜分离到芜菁花叶病毒6个分离物.利用 RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因(CP), 测定了它们的核苷酸序列并进行了序列分析. 结果表明,6个分离物的 CP基因均为864个碱基,核苷酸序列同源性较高, 达 97.0%～100%;它们与 world-B组分离物的同源性最高,达 92.1%～100%;与 basal-B组分离物的同源性最低,仅 87.6%～90.2%. 基于 TuMV的 CP基因核苷酸序列的分子进化树显示,TuMV分离物可分为4组,本研究所分离到的6个 TuMV四川分离物属于第四组,即 world-B组.     

水稻OsICK1基因克隆及其序列分析

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ICK)是一种能够影响细胞生长和发育的重要调控蛋白.以水稻(9311)为材料,利用RT-PCR技术,扩增获得了1个新的可能为水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因,命名为OsICK1.核苷酸序列分析表明,该基因的开放阅读框为585 bp,编码194个氨基酸.与Genbank中预测的水稻ICK基因序列(NM_196964)比对,两者同源性为79.84%;氨基酸序列分析表明,该基因氨基酸序列3′端附近存在植物ICK所固有的保守序列,与玉米ICK1保守序列的同源性高达95.5%.     

藏绵羊脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、T-A克隆技术获得了藏绵羊H-FABP基因, 并对克隆序列进行分析. 结果显示, 藏绵羊H-FABP编码基因全长402bp, 编码133个氨基酸. 将藏绵羊H-FABP基因及氨基酸序列分别与Gene Bank中公布的山羊、水牛、家牛、野牦牛、猪、马、狗7种动物进行序列一致率比对, 结果显示, 藏绵羊与所选的7种动物的H-FABP基因序列一致率在90.8%～99.5%之间, H-FABP氨基酸序列一致率在93.2%～100%之间. 其中, 藏绵羊与藏山羊H-FABP基因存在2个位点核苷酸差异:114位碱基位点A→G和第129位碱基位点T→C, 但两个位点的核苷酸差异均为同义密码子, 藏绵羊与山羊H-FABP氨基酸无差异.     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

天人菊matK基因克隆及生物信息学分析

为了完善天人菊的遗传信息,丰富菊科植物分子生物学分析数据.通过PCR扩增、基因克隆获得天人菊matK基因的完整核苷酸序列,采用生物信息学方法分析天人菊matK蛋白的结构及性质,并与其他12种matK氨基酸序列进行对比,构建系统进化树.结果表明,天人菊matK基因全长1296 bp,可编码432个氨基酸,二级结构以α-螺...     

Genome organization and phylogenetic tree analysis of Garlic virus E, a new member of genus Allexivirus

The complete sequence of an Allexivirus isolated from garlic plants in Yuhang City, Zhejiang Province, China had been determined. The single-strand, positive RNA genome was 8451 nucleotides in length excluding poly(A) tail. The genome organization of this virus was similar to that of the other Allexiviruses but only with 62.8%-64.8% nucleotide acid identities. The amino acid sequences of proteins encoded by ORF1-6 shared 67.6%-78.5%, 55.4%-66.2%, 56.7%- 66.4%, 40.3%-55.6%, 66.3%-79.7% and 52.2%- 68.8% identities with those of the others respectively. The homology range between it and the other Allexiviruses was similar to that between the other distinct species in this genus. A more comprehensive comparison using all available CP amino acid sequences showed that it shared only 63.9%- 79.8% amino acids identical with the others. Therefore, it had been considered as a new member of the genus, named as garlic virus E (GarV-E). Phylogenetic analysis confirmed GarV-E as a distinct member and the correct names and classification of some members of genus Allexivirus were also discussed.     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

南阳黄牛CD14基因扩增及序列分析

根据GenBank发表的荷斯坦奶牛CD14基因的序列设计引物,通过PCR方法对南阳黄牛的CD14基因进行分段扩增并测序,拼接后得到包含CD14完整编码区以及5’端和3’端非编码区的2 969 bp的全序列。序列分析结果表明:南阳黄牛CD14基因开放阅读框全长966 bp,共编码321个氨基酸,碱基组成分别为A(18.4%)、T(18.4%)、C(32.9%)、G(30.2%),编码区与荷斯坦奶牛CD14基因相比发生了2个碱基突变,没有引起氨基酸的改变。在5’端和3’端存在较长的非编码区,与荷斯坦奶牛CD14基因相比发生了7个碱基突变。南阳黄牛的CD14基因与荷斯坦奶牛、水牛、绵羊、山羊、猪、猕猴、大猩猩、人、小鼠的同源性依次降低,分别为99.8%、98.2%、96.8%、92.8%、83.5%、79.8%、79.7%、79.5%、71.9%。进化树所得的聚类结果与传统的分类结果一致。通过蛋白质结构预测,发现南阳黄牛CD14没有跨膜结构域。     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

旱麦草LEA3基因的克隆与序列分析

为了克隆旱麦草LEA3基因,根据小麦的LEA3基因(GenBank登录号为AY148492)cDNA序列设计引物,以干旱胁迫处理的旱麦草幼苗的cDNA为模板,采用RT-PCR克隆了旱麦草LEA3基因,命名为EtLEA3(GenBank登录号为KJ123698),并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:EtLEA3基因的ORF全长为600 bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白相对分子量为20.38 ku,理论等电点为9.08。其氨基酸序列与小麦、大麦和山羊草LEA3蛋白的相似性分别为83%、82%和81%。信息学分析表明EtLEA3蛋白具有较高的亲水性,没有跨膜结构。蛋白质二级结构和三级结构预测表明α-螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。该蛋白含有5个完整的11个氨基酸组成的串联重复单元。这些特征均与第3组LEA蛋白的特征相符合。该研究结果为深入了解该基因的功能和旱麦草抗旱的分子机理提供了基础数据。     

降解多环芳烃的鞘氨醇单胞菌ahdA1c基因的生物信息学分析

ahd A1c基因是鞘氨醇单胞菌降解多环芳烃中的关键基因。为了解鞘氨醇单胞菌ahd A1c基因基本特性,运用生物信息学方法预测分析其氨基酸理化性质、同源性、蛋白二三级结构、KEGG通路等。结果表明,ahd A1c基因编码区全长1 263 bp,编码420个氨基酸,与xylk基因、bph A1c基因的同源性均在90%以上;同源性较高;ahd A1c蛋白具有亲水性和稳定性,有31个磷酸化位点,2个保守区域,有跨膜区,无规则卷曲是二三级结构中最主要结构元件;KEGG分析表明ahd A1c蛋白编码水杨酸羟化酶。为进一步研究多环芳烃的降解机理奠定了基础。