利用酵母双杂交系统筛选油菜ATP6的相互作用因子

甘蓝型油菜波利马(Brassica napus pol.)细胞质雄性不育系是一种很有实用价值的油菜不育类型.目前关于其分子机制的研究已证实,线粒体ATP合成酶的一个亚基ATP6与其雄性不育相关.本实验以ATP6作为诱饵蛋白,应用酵母双杂交共转化的方法筛选与ATP6相互作用的蛋白质.在获得的阳性克隆中,发现了一个与拟南芥中未知基因AT3G47550所编码的蛋白质具有较高同源性的蛋白质.它含有RING HC的结构,可能在泛素-蛋白质降解途径与细胞质雄性不育间建立起了某种联系.     

甘蓝型油菜BnTR1和ATP6之间相互作用的研究

为进一步研究ATP6和BnTR1之间的相互作用及具体作用位点,通过构建含不同长度的BnTR1 cDNA序列的pGADT7融合载体,利用酵母双杂交证明了BnTR1的C端92～202位氨基酸序列与ATP6的氨基酸序列具有相互作用.     

酵母双杂交技术筛选与Axin相互作用的蛋白质

肿瘤抑制因子Axin以构架蛋白的形式通过Wnt、JNK、p53、TGF-β、G蛋白等众多信号转导途径参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程.为了发现Axin新的相互作用蛋白,进一步研究Axin的多功能性,作者通过酵母双杂交技术,将Axin1基因从SpeI单一酶切位点到3′末端的DNA序列构建到pGBKT7载体作为诱饵,对小鼠脑的cDNA文库进行筛选,最后获得28个阳性克隆.通过对这些克隆的测序和对所得序列的生物信息学分析,得到13个与Axin的C末端相互作用的蛋白质,这些蛋白主要参与胚胎发育,肿瘤形成,蛋白翻译后修饰等生物学过程的调节.这一结果为进一步研究Axin的新功能提供了很好的线索.     

利用酵母双杂交系统筛选IrrE相互作用蛋白

本研究通过酵母双杂交技术,构建了IrrE蛋白为诱饵载体,从拟南芥cDNA文库中筛选与IrrE诱饵蛋白相互作用的功能蛋白.研究结果表明,在所获得的阳性克隆中,发现了一个与拟南芥基因At1g01470所编码的蛋白有较高同源性的蛋白,即LEA14蛋白（晚期胚胎发育富集蛋白）,同源性高达98%.推测IrrE转录因子在提高植物耐盐性的过程中起了重要作用.     

油菜细胞质雄性不育相关基因的筛选

甘蓝型油菜波利马(Brassica napus pol.)细胞质雄性不育系是一种很有实用价值的油菜不育类型.目前关于其分子机制的研究已证实,线粒体ATP合成酶的一个亚基ATP6与其雄性不育相关.本实验以ATP6作为诱饵蛋白,应用酵母双杂交共转化的方法筛选与ATP6相互作用的蛋白质.在获得的阳性克隆中,发现了一个与tAPX基因及其表达的蛋白都具有较高同源性.它是活性氧清除的重要酶类,很可能与细胞质雄性不育间建立起了某种联系.     

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

研究蛋白质相互作用的新系统——酵母双杂交系统

自酵母双杂交系统创建以来,已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段,被广泛用于各个生物学研究领域,揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用,近来,在经典的酵母双杂交系统基础上,又相继提出许多新的研究方法,如：三杂交系统,单杂交系统,逆向双杂交系统,ＳＯＳ富集系统等,酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用于蛋白质之间,蛋白南与ＤＮＡ、ＲＮＡ、配体之间的相互作用的研究。     

酵母双杂交筛选与视黄醇结合蛋白有相互作用的蛋白质

为了研究视黄醇结合蛋白(RBP)在维生素A代谢调控中的作用和与相关疾病发生、发展的关系,以RBP作为诱饵基因构建了融合表达载体pGBKT7-RBP;在排除自身转录激活活性的基础上,与人肾脏cDNA预转库融合筛选(Pretransformed MATCHMAKER Lbraries),经营养缺陷型和X-α-gal显色鉴定,从中筛选出三种与RBP有相互作用的新蛋白质,并从人睾丸cDNA库中克隆了这三个基因的全长序列。     

利用酵母双杂交筛选与谷氨酰tRNA合成酶相互作用的蛋白质的初步研究

使用拟南芥作为模型,采用筛选出和谷氨酰tRNA合成酶有相互作用的蛋白质的方法研究谷氨酰tRNA合成酶在植物中可能具有的未知功能.首先利用反转录PCR方法获得拟南芥的cDNA,然后通过酵母双杂交系统,用拟南芥的谷氨酰tRNA合成酶作为诱饵对拟南芥cDNA文库进行筛选,并获得多个阳性菌落.对该菌落进行进一步的鉴定得到和谷氨酰tRNA合成酶具有相互作用的蛋白质,这对进一步研究谷氨酰tRNA合成酶及其相互作用蛋白质参与的生命活动奠定基础.     

酵母双杂交筛选与脱落酸受体相互作用的蛋白质及其重转酵母的验证

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,它能使植物适应逆境胁迫,从而调节植物的生长发育状况.现今ABA受体已被公认为RCARs/PYR/PYLs家族蛋白.本实验通过拟南芥为模式植物,利用酵母双杂交系统共转化方法从拟南芥cDNA文库中筛选与RCAR3相互作用的蛋白质,获得多个阳性克隆,从中选取一个与生长素调节相关的基因NIT1的全长cDNA重新转化酵母验证,发现与RCAR3仍然有相互作用,排除了假阳性的可能.从而为下一步研究该基因与RCAR3的相互关系做好了准备.     

与ATP6相互作用的蛋白质的筛选和Bn HDL基因的cDNA克隆

以与甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育有关的atp6基因作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交技术,筛选甘蓝型油菜的cDNA文库,寻找与其相互作用的蛋白质.根据筛选所获得的其中一个阳性克隆的序列,利用RACE技术和TAIL PCR技术,获得该基因的全长cDNA序列.将氨基酸序列在NCBI上进行Blast比对分析,具有水解酶家族17的保守结构域,与拟南芥的beta-1,3-glucanase 5具有84%的同源性,可能为水解酶家族的一个成员,暂定该蛋白质为Bn HDL.     

拟南芥ATP6与PSAL蛋白质之间的相互作用研究

本文利用酵母双杂交系统研究了拟南芥中全长atp6与不同长度psaL之间的相互作用,通过观察含有共转化质粒的酵母,在组氨酸(His)和腺嘌呤(Ade)营养缺陷条件下的生长情况,以及对β-半乳糖苷酶(LacZ基因编码)的定性和定量分析,表明ATP6与PSAL之间具有较强的相互作用,并且这种相互作用在全长atp6和psaL的中间区段,PSAL的信号肽和C端的存在阻碍了这种相互作用.     

油菜细胞质雄性不育相关基因表达差异研究

利用半定量RT-PCR与荧光定量PCR手段分析ATP6、tAPX在甘蓝型油菜不育系与恢复系中的基因表达差异.结果表明, ATP6、tAPX在不育系花中的表达量比在恢复系花中的低. 因此,油菜花中ATP6、tAPX基因表达模式具有较强的相似性,再次证实ATP6与tAPX相关.     

Screening and Insert Size Analysis of Candidate C-Genome BAC Clones from Brassica napus

Thirty-two C-genome specific candidate bacterial artificial chromosome (BAC) clones were successfully screened from the BAC library by four-dimensional PCR method with the primer pairs of 75 simple sequence repeat (SSR) markers located in the nine C-genome linkage groups of Brassica napus. The screened 32 BAC clones have an average insert size of 114.2 kb with a range of 30-190 kb. They are the first set of C-genome BAC clones screened from B. napus genomic BAC library. The average insert size of this set of BAC clones presented that the constructed BAC library had a high quality. This set of BAC clones can be used as markers to identify individual chromosomes of B. napus C-genome.     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.