新型核苷碱基卤化酶AcmX的原核表达和结晶实验

在链霉菌中发现了一类能对核苷碱基进行特异位点卤化修饰的新型卤化酶,可用于核苷类药物的卤代优化。对新型核苷碱基卤化酶晶体结构的解析,是阐明其生物催化的机理,建立生物催化卤化制备核苷类药物的最直接手段。为了获得一个卤化酶AcmX的晶体结构,首先通过大肠杆菌原核表达制备AcmX蛋白样品,但只能得到没有活性的AcmX的蛋白包涵体。通过构建AcmX、分子伴侣蛋白共表达系统,注意控制合适的分子伴侣蛋白表达水平,并通过高分辨率的分子筛凝胶层析步骤,去除混入AcmX样品的分子伴侣蛋白GroEL,摸索出表达和纯化高质量AcmX蛋白样品的方法,并将蛋白样品成功用于结晶实验。这不仅为解析卤化酶AcmX的晶体结构打下坚实的基础,还可将本研究的方法用于其他表达困难的蛋白的制备。     

假坚强芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的原核表达纯化与结晶

丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase,Ald)是一种NAD+依赖性的氨基酸脱氢酶,能可逆地催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸和氨.实验以假坚强芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶为研究对象,将目的基因克隆到p ET-22,b(+)原核表达载体上,并在大肠杆菌中完成蛋白的高效表达.通过镍离子亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化方法,得到了高纯度的目的蛋白.利用气相扩散法对目的蛋白进行结晶,最终得到分辨率为0.31,nm的蛋白晶体.     

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。     

黄连对羟苯基丙酮酸双加氧酶的原核表达和酶学性质

为了研究黄连对羟苯基丙酮酸双加氧酶(CjHPPD)的功能和性质,在E.coli中异源表达其编码cDNA得到了重组的CjHPPD.经HPLC和LC-MS检测确定重组CjHPPD具有催化对羟苯基丙酮酸形成尿黑酸的酶活性.酶学特性分析表明,CjHPPD催化尿黑酸形成的最适pH值为6.5,产物尿黑酸的积累至少在反应开始10min内随时间呈线形增长,最适反应温度为30℃.以ρ-HPP为底物进行底物亲和性分析表明,CjHPPD符合Michaelis-Menten动力学曲线,Km值为43.2μmol/L.结果表明,CjHPPD的Km值明显高于其他已报道的植物HPPD的Km值,高Km使得CjHPPD具有较强除草剂抗性.     

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

扩展青霉TS414脂肪酶的克隆与原核表达

提取了扩展青霉Penicillium expansumTS414菌体的总RNA,并以反转录得到的cDNA为模板,成功扩增得到了脂肪酶基因;在此基础上,构建了重组表达载体pGEX-4T-1-PEL,并在大肠杆菌DH5α中实现了扩展青霉脂肪酶的表达;进一步采用低IPTG诱导浓度、低温、长时间的发酵策略等,使扩展青霉脂肪酶得以有活性的表达;同时,通过反复冻融细胞破碎法使其较好地从菌体细胞中分离出来,提取得到的酶液的活力达到0.49 U/mL。以上结果为后续脂肪酶分子进化等研究奠定了坚实的基础,亦可转化为高校或中学生物学实验教学的项目。     

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。     

葡萄球菌新型肠毒素rSEP的原核表达与纯化研究

通过对扩增的金黄色葡萄球菌sep基因序列进行载体构建和双酶切鉴定,将酶切验证的pET-30a-SEP重组质粒分别转入不同的大肠杆菌表达宿主中,选择出最佳表达宿主菌,并进一步优化表达条件,实现重组融合蛋白(rSEP)的可溶性表达;采用Ni~(2+)亲和层析最终获得纯化的rSEP蛋白.研究结果为后续制备单抗、诊断试剂及肠毒素SEP蛋白的致病机制研究奠定基础.     

Abd-Bcr/Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响.以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确.再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确.通过转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化.结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6 kd的目的蛋白,Westem blot鉴定为特异表达.证明成功构建了原核表达载体pE732a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Westem blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础.     

新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a( ),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210 μg/L.     

桃褐腐病菌角质酶基因的克隆与原核表达

采用PCR法克隆了桃褐腐病菌的角质酶基因cutl,构建了诱导型表达载体pET28a-cutl,转化大肠杆菌E. coli(BL21),获得重组菌pET28a-cutl/ BL21。经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,该重组菌角质酶的表达量约为对照菌的1.69倍,酶活约为对照菌的1.8倍,粗酶液的酶活可达40.33U/mL。     

小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备

目的:利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps),并制备抗meClps抗体。方法:通过生物信息分析meClps蛋白结构,Oligo 6设计引物,PCR法从小鼠附睾cDNA中扩增meClps全长序列并克隆到pMD19-T载体中。将含meClps序列pMD19-T载体通过PCR扩增成熟肽区段序列,重组到pET-21b原核表达载体上,经菌落PCR及测序鉴定后,转化到表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2 mol/L尿素洗涤,Tricine-SDS-PAGE分离、染色、脱色,切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清,Western blotting检测抗体与meClps反应。结果:在原核表达系统成功重组表达meClps,目的蛋白主要以包涵体形式存在,制备了高效价的兔抗meClps抗体。结论:成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。     

土元溶栓蛋白的原核表达和活性检测

本文利用兼并引物成功克隆到土元类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因,通过构建该基因的原核重组表达载体及IPTG体外诱导,包涵体蛋白复性,Ni 2+柱亲和层析纯化,最终获得了重组表达目的蛋白.经体外检测,该蛋白具有较好的溶栓活性,这为揭示土元溶栓作用的分子基础及其进一步的开发利用奠定了基础.     

头孢菌素C酰化酶S12在不同原核系统中的表达

目的：构建头孢菌素C酰化酶（Cephalosporin C Acylase）基因的两种原核表达载体,确定高效原核表达体系。方法：人工合成头孢菌素C酰化酶S12基因,分别克隆到含有Lac启动子的载体pBC KS和T7-lac启动子的载体pET-28a上,命名为pBC-S12和pET-28-S12,重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）,表达纯化目的蛋白S12,测定酶活。结果：成功地构建了头孢菌素C酰化酶S12的原核表达菌株,组成型表达和诱导型表达体系的表达量低,目的蛋白具有酶活,诱导型表达产生的酶比组成型表达产生的酶具有更强活性,可作为大肠杆菌表达头孢菌素C酰化酶的高效表达体系。     

丝瓜ACC合成酶的原核表达、分离纯化及性质鉴定

将构建成功的丝瓜ACC合成酶cDNA的重组质粒, 转化为大肠杆菌BL21（DE3）, 经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后得到特异性高效表达, 表达蛋白以包涵体形式存在. 包涵体经洗涤和Zn^2＋螯合柱层析, 得到纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白分子量为55 000的单一蛋白带. 经活性分析, 该酶最适pH值为8.5, 米氏常数（K_m）为44.2　μmol/L.     

拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

密码子的碱基关联与表达增强网络

提出了基因表达水平与碱基顺序关系的表达增强网络（ＥＥＮ）模型，认为ＥＥＮ与编码区中密码子的某些特定位点相关联，这些位点称为ＥＥＮＳ．用统计分析的方法证实了ＥＥＮＳ的存在，并对Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｙｅａｓｔ找出了这些位点．发现表达水平不仅与同义密码子的使用、且与密码子第１第２位点（特别是１位点）有关，因此Ｉｋｅｍｕｒａ的ｔＲＮＡ丰度说是不完全的。发现ＥＥＮ在编码区中可能具有很大的尺度，而不局限于相邻密码子，因此ｔＲＮＡ－ｔＲＮＡ相互作用说是不完全的．     

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表达

bZIP类转录因子参与调控多种生物学过程,包括植物生长、花的发育、种子的成熟、衰老、光信号传导、损伤修复、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。文章构建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了蛋白表达;提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR克隆AtbZIP19与AtbZIP23基因cDNA全长;将pET-32a+载体和聚合酶链反应(PCR)产物进行双酶切,通过DNA连接反应将2个基因定向克隆到pET-32a+质粒中;经菌液PCR和测序鉴定获得阳性克隆后,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达得到目的蛋白。     

人源雄激素受体DNA结合结构域的原核表达与其响应元件的复合物结晶

为获得高分辨率的雄激素受体与其响应元件的复合物晶体结构,为前列腺癌的治疗提供药物靶点设计的理论基础.本研究构建了AR-DBD的原核表达载体,在0.5 mmol/L IPTG,16℃条件下诱导24 h表达该蛋白.通过与AR响应元件寡核酸的结合优化蛋白纯化条件,使AR-DBD蛋白易于纯化.最终,蛋白核酸复合物晶体呈现出边缘清晰,短棒状的立体结构,本研究制备的蛋白核酸复合物晶体可直接用于X射线衍射分析.