非休眠期成年牛耳成纤维细胞用于核移植

哺乳动物的自然生殖方式是有性生殖 ,需要精子和卵子进行受精作用 .核移植技术为哺乳动物无性生殖提供手段 .以前 ,人们多采用未分化或分化不完全的胚胎细胞作为供核细胞 .自Wilmut等人应用成年绵羊体细胞作为供核细胞进行核移植获得全程发育以来 ,体细胞核移植已在多种动物上获得成功 .Wilmut等人认为 ,应用G0 期成年体细胞作为供核细胞是核移植成功的关键 (“G0 期假定”) .为了验证“G0 期假定” ,我们用非休眠期成年牛耳成纤维细胞作为供体 ,以去核牛卵母细胞 (体外成熟 )作为受体进行核移植 .实验中核移植后电融合率达5 1 .6 % ,融合后重组卵卵裂率达 5 4.5 % ,并且有 9.1 %发育到 32细胞期 .这些结果表明 :处于非休眠期的成年牛供核体细胞移植到去核卵母细胞至少能进行早期发育     

我国人类胚胎干细胞研究取得突破性进展

英国的多利羊虽然已经因病去世,但它来到世上确实证明,把分化了的体细胞核移植到去核卵细胞的细胞质里,可使植入的细胞核去分化或重新编程,而使融合细胞发育成为一个胚胎和独立的个体.     

对“多利”羊的思考

当英国科学家维尔穆特成功地用体细胞克隆出“多利”羊之后，在世界上掀起了一股轩然大波。卷入这场克隆热的，不仅有科学家，政治家，而且还包括普通老百姓。大家为什么热衷于“多利”羊呢？它带给我们什么？其实克隆动物的成功，在此之前早已有之。从两栖类动物，到鱼类，直至哺乳动物，生物学家都成功地克隆过。当初仅仅作为一项科学研究的成果，写成论文发表，这是司空见惯的，不足为奇。唯独这克隆羊非同一般，这是因为，它是用体细胞的遗传物质，说得具体些是用一头6岁的母绵羊的乳腺表皮细胞的细胞核，移植到一个受精但去核的受精卵…     

克隆器官

克隆技术的基础是细胞核的移植。通常接受核植入的细胞取自刚刚排卵动物的未受精卵，一旦这些卵受到培养，它们就开始发育。而供核细胞就是要进行复制的细胞。在高倍显微镜的帮助下，用一支细移液管一端吸住卵细胞使之固定，并用另一支微量细移液管抽取染色体中的DNA。将供体细胞连同其核与受体卵细胞融合在一起，将其植入母体子宫里，就会开始如正常胚胎那样发育并产生后代。这就克隆出一个新生命。克隆一旦涉及人类自身，就会出现伦理学问题。所以，虽说技术上可以，但伦理上绝不允许克隆人体的做法。不但美国、英国反对，中国也反对。…     

从乳腺细胞复制羊

多少年来，一个使发生生物学家感兴趣的老问题就是基因组在动物发生过程中的恒定性。换句话说，胚胎的发生、分化和生长是否会对体细胞的基因组产生不可回复的修改。维尔穆特（I．Wilmut）及其同事阐述了他们以前的发现：通过移植细胞核到去核的卵细胞中去可以复制出羊，这个细胞核是从在非常早期的羊胚胎中建立起的细胞系中得来的。现在他们表明同样的方法可用于从来自于更成熟胚胎的细胞系那儿得到活的羊。尤其引人注目的是，已经从6岁母羊乳腺建立的细胞系中获得了一只活的羊。其结果具有极其深远的意义。这些结果不仅确认基因组（免疫…     

克隆人类胚胎:制造天使还是放出魔鬼?

人类胚胎首次克隆潘多拉盒终于打开2 0 0 1年 11月 2 5日 ,位于马萨诸塞州的美国先进细胞技术公司 (ＡＣＴ)宣布已成功克隆出人类胚胎。就像当年第一只克隆羊诞生所带来的巨大冲击一样 ,人类克隆胚胎的出现 ,国际医学界为之震动 ,围绕该研究的伦理道德问题再次摆在世人面前。美国先进细胞技术公司的首席执行官米歇尔·韦斯特 (ＭｉｃｈａｅｌＷｅｓｔ,见图 )在宣布这一成果时说 :“这次实验采用了 8个卵细胞样本 ,其中的两个形成了 4个细胞的胚胎 ,在分裂到 6个细胞时停止了分裂。”韦斯特还说 ,首次克隆出的人类胚胎“很初级” ,数目还不足…     

体细胞克隆中核的重编程

尽管体细胞克隆在绵羊、牛、小鼠、猪、山羊、兔、猫、大鼠和骡子等物种中都获得了成功, 但却未能得到狗和猕猴的克隆个体, 而且克隆效率非常低. 克隆效率低使体细胞克隆技术在科研和生物技术等方面的应用受到限制. 供体核移入去核的卵细胞后, 必须经过表观遗传修饰的重编程, 回到胚胎开始发育的全能状态. 目前认为: 供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因. 本文从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、端粒、印记基因以及其他发育相关基因的表达几个方面来探讨影响克隆效率的因素.     

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。     

不同品系间斑马鱼的细胞核移植

以斑马鱼AB品系囊胚晚期胚胎细胞为细胞核供体,以斑马鱼长鳍品系未受精的去核卵为受体,进行不同品系间斑马鱼的细胞核移植,采用显微注射法,操作胚胎1119枚,获得克隆鱼14尾,RAPD分析显示,克隆鱼与细胞核供体鱼的DNA扩增带纹一致而与受体鱼不同,表明克隆鱼的遗传物质来源于供体细胞核,模式动物斑马鱼的细胞核移植技术的建立,有望在研究动物发育过程的基因功能、细胞核的发育潜能及核质关系等重要问题上发挥作用。     

来源于哺乳动物胚胎细胞和成体细胞的成活后代

哺乳动物卵母细胞受精后随之开始连续的分裂和分化，先是形成早期胚胎．然后形成构成成年动物的各种类型的细胞。将处于发育到某一特定阶段的单个细胞的核转入已去核的未受精的卵母细胞，这为观察细胞分化至该阶段是否涉及不可逆的遗传修饰提供了一个机会。首例由诱导进入静止期的已分化的胚胎细胞核移植发育而成的后代已经诞生。用同样的方法，我们在此报道来源于成体乳腺、胎羔和胚胎建立的三种新细胞群的成活羔羊的诞生。羔羊来源于成体细胞这一年实证实了，这种细胞的分化并未涉及发育所需的遗传物质的不可逆修饰、来源于已分化的胎羔细…     

克隆技术对人类的贡献

1997年2月,《自然》杂志上发表了英国罗斯林研究所Ⅰ.维尔莫特等人关于克隆羊的论文,在科学技术界引起强烈的振动,至今余波未息。论文宣布了克隆羊“多莉”的诞生,这是一件具有划时代意义的成果。 Ⅰ.维尔莫特等人首先把一头成年羊乳腺细胞的细胞核取出,通过显微注射的方法注入另一只去掉细胞核的羊卵细胞中,然后让这个装配的卵细胞在代孕母羊的子宫里发育成一个完整的胚胎,这就实现了动物的无性繁殖。这种克隆技术使用的是体细胞核移植,打破了生物学上所     

低氧培养早期胚胎克隆小型猪(Sus Scrofa)

猪的体细胞克隆在人类的异种器官移植方面有着巨大的应用前景. 以中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞为核供体, 从屠宰场采集初情期前母猪的卵巢, 卵母细胞体外成熟后去核构建克隆胚胎, 重构卵电融合并激活, 在7% O₂, 5% CO₂及88% N₂的气相条件下NCSU-23或PZM-3培养基培养. 给3头代孕母猪移植230枚克隆胚胎, 其中一头妊娠足月并产下3头仔猪, 生产克隆猪的效率达到1.3%; 其中一头健康状况良好, 存活至今, 毛色及DNA微卫星遗传分析证实为克隆个体. 以上结果表明, 利用初情期前母猪的卵母细胞, 克隆胚胎培养在低氧条件下, 是生产克隆猪的一条有效途径.     

克隆人诞生,福兮祸兮

2002年4月,多国媒体纷纷报道了一个重大消息:曾引起广泛争议的意大利妇科医生塞韦里诺·安蒂诺里5日在阿拉伯联合酋长国阿布扎比参加一个有关克隆和基因工程的学术会议时宣布,他正在进行一项克隆人的计划,有5000对夫妇参加了该计划,而且目前有一名妇女已经怀有8周身孕。安蒂诺里介绍说,自己的搭档就是克隆界鼎鼎大名的美国人帕诺斯·扎沃斯博士。他们利用克隆技术,移出成熟体细胞中含有细胞遗传物质的细胞核,将这些细胞核移入到已经被移除了自身细胞核的人卵细胞中,这些卵细胞随后受刺激而分化,并发育成胚胎,然后再被植入到子宫内。如果报道属实,这位妇女怀的将是得到确认的人类历史上第一个     

山羊(Capra hircus)胚胎细胞经继代细胞核移植后其发育能力的研究

细胞核移植是研究细胞核和细胞质相互关系问题的最理想的方法之一.继代细胞核移植或称再克隆(recloning)可以了解同一胚胎分裂球或细胞经继代细胞核移植之后,它们全能性的功能是否有变化,如有变化,在第几代开始有变化,如没变化则能稳定几代.如果继代细胞核移植可行的话,将会成为获得大量基因型等同的无性繁殖系动物的理想方法.本文主要研究山羊胚胎的分裂球或细胞经继代核移植后仍具有全能性发育的可能性.本实验结果首先在国内外获得了一批继代核移植后的小羊羔.为我国优质家畜克隆动物的繁育奠定了理论和技术的基础.     

单受精卵的双胎绵羊生育方法

英国年青学者S.M.Willadsen研究成功一种能在良好条件下冰冻牛和绵羊胚胎的方法。为此,他成为此项世界科学研究中第一个杰出的科学家。他以一种独创的方法,分离多产牛的最初二个胚胎细胞(分裂球)来得到双胎绵羊。他从供者绵羊身上取出2个细胞期的胚胎,然后将其储存在富磷酸盐的盐性缓冲溶液中。借助微型外科仪器,胚眙周围的透明带被撕裂,吸入并分离2个分裂球。每个分裂球重新进入事先排泄的透明带内。然后,每一对分裂球插入一个袖口状琼脂保护套膜内。在分裂球循环的第一、二天,袖口状琼脂保护套膜转移到受者绵羊的输卵管内。在输卵管里,由于补偿透明带损失的琼脂的作用,那时的每个分裂球就象卵一般地起作用。     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞,G418筛选后,各取1株阳性转基因细胞作供体,进行绵羊的体细胞核移植（克隆）,共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合,得到的329枚核移植胚胎（93．5％）,用Ionomycin／6－DMAP激活,SOFaaBSA液滴体外培养7d,结果显示,312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％）,其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％）,随机抽检发现,克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％,8／49）没有显著差异（P＞0．05）,结果表明,体细胞基因转移和克隆技术的结合,可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。     

核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

中国红系冀南黄牛的克隆及其繁殖性能

以濒临灭绝的中国红系冀南黄牛的颗粒细胞为核供体进行了体细胞克隆研究. 共操作卵母细胞211枚, 去核166枚(79%), 构建重构胚112枚(67.4%), 其中分裂的重构胚为94枚(83%), 第7天发育成囊胚数为48枚(43%). 共移植荷斯坦奶牛受体6头, 妊娠2头(33%), 其中1头流产, 另1头产出一头健康牛犊. 比较了不同融合液(甘露醇和Zimmerman融合液)对克隆胚胎融合率和囊胚发育率的影响以及不同激活方法(钙离子载体(A23187)+6-DMAP和放线菌酮+CB)对克隆胚胎囊胚发育率的影响. 结果表明: (ⅰ) 在电场强度为2.5 kV/cm, 脉冲时间为10 ms, 脉冲次数为2的条件下, 克隆胚胎在甘露醇融合液中的电融合率比在Zimmerman融合液中的电融合率高(71% vs 61%, P＜0.05), 且囊胚发育率差异不显著(36% vs 39%, P＞0.05 ); (ⅱ) 以钙离子载体(A23187)+6-DMAP激活组与放线菌酮+CB激活组处理的克隆胚胎囊胚发育率无明显差别(42% vs 46%, P＞0.05). 依据牛的28个微卫星位点对供体牛、克隆牛和代孕母牛进行微卫星分析, 结果表明, 克隆牛与供体牛的遗传物质完全相同, 而与代孕母牛在遗传上无任何相关. 目前, 该克隆冀南黄牛已经产犊, 克隆冀南黄牛的各项繁殖性能指标均与正常冀南牛犊相符, 所产牛犊的生长发育正常.     

重新认识高等动物成熟体细胞的发育潜能

高等动物从受精卵发育成为成熟个体遵循严格的时间空间顺序并受到严密机制的调控,一般认为是不可逆的过程．高度分化的成熟终末细胞通常不再进行分裂和分化．１９９７年,克隆羊Ｄｏｌｌｙ的诞生首次揭示哺乳动物成熟体细胞的细胞核具有发育全能性,在适当的条件下,可以恢复发育状态,甚至发育成为完整的个体．目前应用核移植技术,已经成功克隆小鼠、兔、羊、牛等多种哺乳动物．但对于成熟体细胞本身是否也具有类似的发育潜能尚不能完全解释．最近的一系列新发现证实,在成熟机体多种组织系统中均存在可多向分化的多能细胞,在成熟神经细…     

连续核移植对异种克隆大熊猫胚胎发育的影响

异种体细胞核移植为拯求濒危动物提供了一条新的途径,已有的异种核移植报道证明,经休眠处理的体细胞核在异种胞质中能完成早期发育,用处于活跃分裂的大勇猛体细胞作为供核细胞移入去核的兔卵母细胞中,经电融合（融合率为71.6%）及电活化后,体外培养获得了4.2%的囊发育率,为了改善重构胚的发育率,采用连续核移植的方法,即用处于活跃分裂的来源于大熊猫－兔异种重松胚的卵裂球作为供核细胞移入去核兔卵母细胞透明带下,共进行3次连续核移植,核移植融合率分别为79.5%,84.1%和78.0%,与体细胞核移植组无显著差异;经电活化后,体外培养的异种重构胚胎获得了显著高于体细胞核移植组的胚胎发育率,囊胚发育率分别为19.4%,13.5%和10.3%（P＜0.05）。这些结果表明,未经休眠的体细胞核也能支持异种重构胚的早期发育,连续核移植可以提高异种克隆大熊猫重构胚的发育率。