一个在麻疯树根和茎高表达的Kunitz型蛋白酶抑制剂基因JcKTI具有抗虫活性

通过RT-PCR和PCR技术,从麻疯树基因组中克隆得到一个Kunitz型蛋白酶抑制剂基因（JcKTI）的开放阅读框序列。对应开放读码框的基因组序列不含有内含子。该开放阅读框长度为540bp,编码一个含有179个氨基酸残基的成熟多肽,具有典型的Kunitz家族结构特征。组织特异性表达研究显示,JcKTI基因在根和茎中的表达丰度最高,在叶片和种子中表达较低。构建原核表达载体pET32-JcKTI在大肠杆菌BL21中表达,获得纯化的重组蛋白,该蛋白显示出一定的抑制牛胰蛋白酶的活性。将该基因在烟草中过表达,明胶酶法和BAEE法的结果均显示转基因植物的蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制作用,进一步的抗虫实验结果表明转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻,并减少对叶片的吞食。上述结果暗示JcKTI基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色。     

转番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因烟草植株的培育及其抗虫特性分析

将分离的番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因cDNA序列tin2和含有一个109bp内含子的基因组DNA序列tin2i,分别构建成植物表达载体pBCT2和pBT2.然后通过农杆菌介导转化烟草叶片外植体,获得了两类转基因烟草植株.分子生物学检测和胰蛋白酶抑制剂活性分析结果表明,tin2序列和tin2i序列都能够在转基因烟草中正确表达.抗虫活性检测结果显示,转tin2i序列的烟草植株的抗虫活性高于转tin2序列的烟草植株,推测这可能与tin2i序列中内含子的存在有关.     

麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IPI)启动子的克隆及瞬时表达分析

本文以麻疯树基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因(JcIPI)起始密码子上游1 536bp的启动子序列.利用在线软件PLACE和PlantCARE分析表明该序列除具备TATA-Box、CAAT-Box等启动子基本元件外,还含有AuxRR-core、TATC-box、MBS、HSE等特异性元件.为确定启动子核心启动区域,构建JcIPI启动子283、550、970、1 276和1 536bp的5′端缺失片段,并将其分别驱动pBI121载体的葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,构建植物表达载体.采用农杆菌介导法转化烟草,在烟草叶片中进行瞬时表达分析.GUS酶活测定结果显示,五个启动子缺失片段都具有启动子活性,并随长度增加而增强.     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

麻疯树JcCBF3基因的克隆及其抗寒功能初探

从麻疯树中克隆到一个CBF3基因,命名为JcCBF3,ORF全长678bp,编码225个氨基酸;氨基酸序列同源性比对结果显示JcCBF3与其他物种CBF序列具有较高的同源性,与木薯和橡胶树的相似度最高,达到79%和74%.RT-qPCR结果表明低温胁迫12h后JcCBF3基因的表达量达到峰值,为对照的62倍.将JcCBF3构建到植物过表达载体pBI121上并成功转化烟草.低温处理下转基因烟草幼苗的游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的增幅均大于野生型烟草,并且JcCBF3基因的过表达增强了含有CRT/DRE元件的下游抗性基因的表达.     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

麻疯树耐冷基因JcCBF2的克隆及表达模式分析

从麻疯树基因组中克隆到一个CBF2基因(命名为JcCBF2).运用生物信息学的分析手段对该基因序列及其编码的蛋白质序列进行了分析,结果表明JcCBF2蛋白中不止包含保守的AP2/EREBP结合结构域,还具有CBF转录因子特征序列PKK/RPAGRxKFxETRHP、DSAWR.实时荧光定量PCR结果显示,JcCBF2基因主要在麻疯树叶片内转录表达,对低温胁迫极其敏感,但对干旱及盐胁迫不敏感,初步研究表明JcCBF2基因是低温诱导型转录因子.     

麻疯树亚硝基谷胱甘肽还原酶（JcGSNOR）的克隆与功能分析

本研究克隆出了麻疯树亚硝基谷胱甘肽还原酶（JcGSNOR）cDNA的全长序列,并分析了其在麻疯树各部位中的表达情况.结果表明,在所有参试的器官中,JcGSNOR基因皆有表达,其中在种子种表达量最大,其次为根茎,叶表达量最少.对新基因编码蛋白的理化性质进行分析后发现JcGSNOR的分子量约为40.256 kDa,等电点约为6.74;同源性分析表明,JcGSNOR基因与其它植物GSNOR基因核甘酸序列相似度达到80%以上,说明JcGSNOR是GSNOR蛋白家族的一个新发现的成员.同时将JcGSNOR基因与pY     

苦瓜McAG2启动子的克隆与表达研究

文中从苦瓜基因组中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5′上游片段并进行了DNA序列分析.通过PCR得到了其缺失片段,将其插入pBI121载体替换CaMV35S启动子,得到了McAG2基因5′侧翼缺失表达载体.并利用农杆菌介导转化烟草,建立了相应的转基因烟草植株,以研究其在不同器官组织中的表达特性. β-glucuronidase(GUS)染色结果显示该启动子在转基因烟草叶片和根组织中没有表达活性.     

麻疯树干旱诱导差异表达基因片段的分离与功能分析

运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),并结合反向Northern杂交筛选麻疯树(Jatropha.curcus)干旱胁迫下差异表达基因,最终从麻疯树叶片中分离出8条干旱胁迫诱导下表达上调的差异片段.经克隆、测序和基因信息分析后发现其中4个片段与GenBank中已知序列有较高同源性.对这4个差异表达片段的序列分析表明:JcDD-3和JcDD-13分别与1-磷酸-肌醇合成酶(MIPS)基因及甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因序列有较高同源性;JcDD-16与白杨中度抗旱叶片中提取的表达序列标签(CU230383)核酸序列同源;JcDD-25与植物富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(LRR-RLK)基因序列同源.     

麻疯树基因JcKNOX1的克隆和表达调控分析

KNOX同源异型盒基因在植物生长发育中扮演着极其重要的角色,首次从大戟科植物麻疯树cDNA中克隆到一个同源异型盒基因,命名为JcKNOX1.其开放阅读框全长693bp,编码230个氨基酸残基,预测蛋白质等电点pI=6.13,分子量PA=25.92kD.聚类分析表明,JcKNOX1与毛白杨在进化上具有最近的亲缘关系,其次是甜橙.荧光定量PCR检测发现,JcKNOX1基因在麻疯树植株各个器官中均有表达,幼嫩部位表达量明显高于成熟器官,表达量依次为:茎尖嫩叶茎叶花叶柄根;对麻疯树幼苗进行ABA和低温胁迫发现,JcKNOX基因表达量明显增加.上游调控元件预测分析表明,该基因可能在麻疯树光调节、激素调控、花粉基因特异性表达、逆境调控等重要生物学过程中具有重要作用.     

表达千穗谷Ah-AMP基因的转基因烟草抗病性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amarathus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜抗菌肽(Ah-AMP)的核基因片段,序列分析结果表明该基因长261bp,编码一个由86个氨基酸组成的Ah-AMP前体多肽.在构建Ah-AMP基因的植物表达载体pBinAH916后,通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草.转化再生植株和T 1 代转基因烟草的PCR和Southern blot分析表明,Ah-AMP基因已整合到烟草的染色体中,并为单拷贝整合.T 1 代转基因烟草的Northern blot分析结果表明,Ah-AMP基因在转基因烟草中至少在mRNA水平上能正常表达.对T 0 代转基因烟草进行烟草青枯病的抗病性试验,筛选出两株抗性较强的植株.对T 1 代抗青枯病的统计分析发现,其抗病性比起始品种SR1分别提高了2.24和1.62个级别;其病情指数比起始品种降低49.6%和37.3%.对黑胫病也表现一定的抗性,主要表现在推迟发病时间,减缓发病速度上.这些结果表明Ah-AMP基因在植物抗病基因工程研究中可能是一个有潜在应用价值的基因.     

RNA干扰降低烟草植株中内源生长素水平

PCR扩增利用吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)全长序列,构建iaaH基因序列正、反向连接的的双元载体,通过农杆菌LBA4404介导,转化携带pTiC58 T-DNA的烟草叶片,获得携带正、反向iaaH序列的转基因植株.ELISA分析生长素的结果表明,转基因植物叶片的内源生长素含量明显降低,仅为pTiC58 T-DNA转化植株的56%,说明转基因烟草中发生iaaH基因转录后沉默,为利用该基因序列启动RNA干扰(RNAi),抑制冠瘿瘤病发生提供了实验依据.     

马铃薯乙醇酸氧化酶StGLO1对模拟水分胁迫的响应

为了解乙醇酸氧化酶在调控植物生长代谢及生物与非生物胁迫过程中发挥的作用。本研究以‘青薯9号’马铃薯为材料克隆乙醇酸氧化酶基因StGLO1,构建过表达载体并转化烟草,观察在干旱胁迫处理下转基因烟草和野生型烟草的长势,并测定了叶片中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量以及转基因根茎叶中StGLO1基因的表达量变化,验证过表达StGLO1烟草在干旱胁迫下的响应。结果表明:StGLO1(GenBank登录号XM_006348318.2)基因CDS为1 116 bp,编码371个氨基酸;干旱胁迫下,转StGLO1基因烟草的生长优于野生型,转基因烟草StGLO1基因的表达量在叶片中最高;转基因烟草中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量高于野生型,达到差异显著水平(P0.05)。该结果为进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

大岩桐GAI同源基因的克隆及功能研究

以大岩桐(Sinningia speciosa)花蕾RNA为模板,利用RACE技术克隆了大岩桐GAI同源基因的全长cDNA,命名为SsGAI(在GenBank中登录号为:FJ594773).序列分析表明,SsGAI的ORF长度为1689bp,编码562个氨基酸,含有典型的植物DELLA结构域以及GRAS结构域.蛋白同源性分析表明,SsGAI与葡萄的VvGAI及陆地棉的GhGAI相似性分别为68%、64%.SsGAI基因在花萼中的相对表达量最高,在茎中表达沉默.将SsGAI置于CaMV35S启动子控制下在烟草中异位表达,转基因烟草表现出植株矮化,花瓣数增加,花期延迟等新表型,表明SsGAI参与了转基因烟草株高及花器官的发育.     

复苏植物牛耳草BhLEA2基因启动子的分离和基因表达模式研究

为研究干旱诱导的基因表达模式,利用Inverse-PCR和Tail-PCR的方法从复苏植物牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R Br．）中扩增出胚胎发育晚期丰富蛋白编码基因BhLEA2的1215bp启动子序列,命名为PBhLEA2。构建了由PBhLEA2启动子引导GUS嵌合基因的植物表达载体pBhLEA2-GUS,并经农杆菌介导导入到烟草中,得到4株转基因烟草植株。GUS检测分析表明,该启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的种子和刚萌发的小苗的子叶和胚轴中高效表达,在10-20d苗龄的植株中不表达,表现出一定的发育阶段和组织特异性。干旱、高盐胁迫及脱落酸（ABA）、乙烯和H2O2等信号分子可在不同程度上诱导GUS报告基因在20d苗龄的转基因植株的叶片中表达,但只有ABA可诱导其在根中表达,表明该启动子对BhLEA2基因表达的调控受环境信号影响。     

棉纤维细胞色素单加氧酶基因GhCYP714A1促进活性氧的累积

本研究利用RT-PCR技术从陆地棉纤维组织中克隆得到了1个棉花细胞色素P450基因(Cytochrome P450714A1)的全长c DNA序列,将该基因命名为GhCYP714A1。序列分析发现,该cDNA包含1563 bp的完整开放读码框,编码521个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为57.31 kDa;氨基酸序列生物信息学分析显示,Gh CYP714A1蛋白具有跨膜结构域和多个蛋白结合位点;进化树分析结果表明,棉花Gh CYP714A1与禾草SiCYP714B1在进化上亲缘关系上较近;半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhCYP714A1基因与纤维突起形成发育有关。本研究构建了pET28a-GhCYP714A1原核表达载体并进行体外诱导表达,获得分子质量约为57.31 kDa的重组蛋白。将GhCYP714A1基因转化烟草验证其参与活性氧产生的功能,与非转基因的野生型烟草相比,转基因烟草叶片中具有较高的H_2O_2累积。本实验结果为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

过量表达SlOPA3-like基因对烟草叶片叶绿体发育的影响

3型视神经萎缩蛋白(Optic atrophy type 3,OPA3)普遍存在于真菌、植物和动物中,但它在植物中的功能尚不清楚。本研究构建了番茄OPA3-like (SlOPA3L)基因的过表达载体35S∶∶SlOPA3L并遗传转化烟草。与野生型烟草叶片相比,过量表达SlOPA3L基因的转基因烟草的子叶呈花叶状、部分组织失绿,转基因烟草的少数早期真叶呈花叶表型,随着叶片发育后又逐渐恢复正常。转基因烟草的叶片细胞表型分析表明:真叶花叶的叶片的海绵组织和栅栏组织发育受到显著的影响。这些结果表明:Sl OPA3L基因可能影植物叶片细胞的分裂和参与植物叶片发育早期的叶绿体形成。     

pap和ipt共表达与提高转基因烟草抗病性的初步研究

通过构建pap与ipt共表达的双元载体,利用农杆菌介导,将pap与ipt共表达基因导入烟草K326品种的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得高表达的转基因植株,并对其进行了攻毒实验.结果表明:pap与ipt共表达基因转化烟草的转化率明显提高(25%),证实转基因细胞中ipt基因表达可降低PAP细胞毒性;接种烟草花叶病毒(TMV)后,pap高表达的转基因植株出现病症的时间延迟20 d,叶片失绿程度较轻,表明该转基因植株对病毒的抗性有一定程度的提高.     

转BnTR1基因的烟草对多种逆境胁迫的抗性研究

将BnTR1基因转化到了本生烟中,发现与非转基因对照相比,转基因烟草对甘露醇和PEG模拟干旱表现出较强的抗性,尤其是PEG胁迫时,三个转基因株系在生物量的积累和整体长势方面都优于对照.干旱处理20d后复水并培养14d后,对照烟草全部枯死,但是所有转基因烟草都恢复生长直至开花结果.当把烟草叶片圆片浸泡在系列盐水中,盐浓度超过600mM时,对照烟草圆片受损白化,而转基因烟草圆片能保持较大面积的绿色。热激蛋白基因HSP90和HSP70在所有烟草中的表达量都有明显提高,其表达量的增加在对照和转基因株系中并无差异,但是在正常条件下不表达的HSF30和sHSP17.6基因在热激处理后都表达了,而且HSF30的表达量增加了50%,sHSP17.6的表达量增加了30%.