HPLC法测定UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT）家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列,构建了三种基因的GST融合表达载体,使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达,从裂解液上清中获 得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物,通过高效液相色谱法(HPLC),测定三种蛋白的酶活力.分析使用的色谱柱为Kromasil C18反相色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,使用的流动相是10%-100%水-甲醇或者10%-20%水-乙腈,分别使用醋酸和三氟乙酸调节了pH.使用梯度洗脱的方式对反应样品进行分析.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外,另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性,UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析,测定出它们的Km值分别为：0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA,对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性,两者Km值差距不大.     

酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列, 构建了三种基因的GST融合表达载体, 使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达, 从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物, 通过高效液相色谱法, 测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外, 另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性, UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析, 测定出它们的Km值分别为: 0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA, 对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性, 两者Km值差距不大.     

拟南芥ABA受体与UGT71B6的相互作用研究

为进一步分析ABA尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶UGT71B6参与植物抗逆反应的具体机制,本研究通过体外酵母双杂交实验与GST-Pull down实验、体内双分子荧光互补实验(BIFC)分析了ABA受体RCARs与UGT71B6之间的相互作用关系.实验结果显示ABA受体RCAR12、RCAR13与UGT71B6,在体内、体外均存在直接的相互作用.研究表明UGT71B6的生理功能与ABA受体之间存在重要联系, UGT71B6可能通过ABA受体的介导参与了植物逆境应答反应.实验结果也为初步探究ABA受体是否参与ABA稳态调节过程提供一定参考.     

拟南芥糖基转移酶基因UGT71C5启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆到长度为903 bp的UGT71C5基因启动子,并构建了此种启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,得到转基因拟南芥,并且通过启动子分析软件对全序列进行分析,发现在该段序列中含有典型的TATA-box、CAAT-box和光应答元件GT1、干旱应答元件ERD等一些顺式作用元件.利用分光光度法测定转基因植株在光照、干旱和ABA等胁迫处理下的GUS酶活力,结果表明：转基因植株的GUS酶活力介于野生型和35S阳性对照之间,与正常条件下生长的转基因植物相比,光照处理     

右旋甲状腺素对Ⅱ相代谢酶UGT2B17抑制的研究

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)主要参与体内多种物质代谢,是人体内最重要的Ⅱ相代谢酶. UGT2B17是UGTs的一种亚型,当UGT2B17的活性被抑制,其代谢的多种内源性和外源性物质在体内蓄积,产生相应的毒副作用.本实验建立经典的体外孵育体系,采用4-甲基伞形酮(4-MU)作为反应底物,测得右旋甲状腺素存在的情况下,UGT2B17对4-MU代谢的残余活性小于20%,后续实验测得抑制动力学参数Ki值为0.064 μmol/L.所以右旋甲状腺素对UGT2B17的活性有强烈的抑制作用.因此在临床中应用含右旋甲状腺素的药物时应注意其剂量,避免引起其对UGT2B17活性的抑制,导致毒副作用.     

结构修饰的穿心莲对UGT2B7抑制能力的评价

临床上穿心莲大多应用于治疗呼吸系统疾病、心血管系统疾病和胃肠道系统疾病等.现今,临床上多存在同时使用两种甚至两种以上的药物,引起体内代谢酶UGTs的代谢抑制,从而引发药物-药物相互作用.本实验主要研究由实验室合成的穿心莲内酯化合物A:zfx-45-7对UGT2B7酶的抑制作用,采用4-甲基伞形酮(4-MU)葡萄糖醛酸化抑制法,以4-MU作为底物对UGT2B7代谢穿心莲化合物的抑制能力做了初步的筛查,测得其残余活性小于20%,继续实验测定抑制常数K_1值为0.15μm0l/L,从而为进一步合成穿心莲药物做出理论和基础实验准备.     

右旋甲状腺素对Ⅱ相代谢酶UGT2B7抑制的研究

临床上应用甲状腺片治疗甲状腺疾病,甲状腺片中含有左旋甲状腺素和右旋甲状腺素,临床发现甲状腺片会影响其他药物的作用,本实验主要研究右旋甲状腺素对UGT2B7的抑制作用.采用4-甲基伞形酮(4-MU)作为底物,测得有右旋甲状腺素存在的情况下,UGT2B7对4-MU代谢的残余活性小于20%,后续实验测得抑制动力学参数Ki值为20.46μmol/L.说明右旋甲状腺素对UGT2B7的活性有强烈的抑制作用.所以临床中应用含有右旋甲状腺素的药物时,应限制用药的剂量,避免引起药物-药物相互作用.     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

油菜籽焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶的动力学研究

采用DEAE-Sephadex A-50及磷酸纤维素柱层析,用底物亲和洗脱法从萌发油菜(Brassica napus)种子中分离纯化了焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(PFP).纯化倍数679.7倍,比活力为21.75 单位/毫克.蛋白,活力回收率22.9%.酶的最适pH值为7.5,Mg2+和M2+n对酶有激活作用.进行酶的初级动力学及稳态动力学研究,对果糖-6-磷酸(F6P)表现为典型的米氏规律,Km值为3.33 mmol/L;对焦磷酸(PPi)的活力变化,在PPi浓度小于1.0 mmol/L时具有部分米氏酶特点(Km＝1.0 mmol/L),大于1.0 mmol/L时,PPi对酶有抑制作用.从两底物F6P和PPi的相互作用以及产物磷酸(Pi)与底物(F6P和PPi)的相互关系分析,初步推断油菜籽PFP的催化反应为双底物双产物的有序机制.     

肺炎衣原体中4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性

来源于肺炎衣原体AR 39的蛋白质NP_444977其功能未知,但BLA ST分析表明此蛋白质可能具有4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性。因此,在大肠杆菌BL 21(DE 3)中诱导表达此蛋白并进行纯化,从而完成酶促反应的分析。结果表明,该蛋白能够催化4-羟基苯甲酸转化为苯酚,证明此蛋白具有4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性。金属离子M g2 、F e2 和C a2 能够增强酶活性,但Cu2 和Zn2 却对酶活无影响。酶促反应中最适的pH及温度分别为7.5和30℃。在最适的pH 7.5和30℃的条件下,蛋白质的米氏常数Km为40.1 mm o l/L。蛋白质还具有底物识别的特异性,能够催化3,4-二羟基苯甲酸转化为邻苯二酚,而不能催化2,4-二羟基苯甲酸转化为间苯二酚,这表明苯环上3′位的配基对酶活无影响。     

对醛基苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用

酪氨酸酶是一种同时具有单酚酶和二酚酶活力的酶．对醛基苯甲酸(ABA)对蘑菇酪氨酸酶活力的影响研究结果表明：ABA只对蘑菇酪氨酸酶的二酚酶活性有抑制作用．而对单酚酶没抑制作用．ABA对二酚酶的抑制作用显示浓度关系，测定导致酶活力下降50％的抑制剂浓度(IC50)为0．98mmol／L．ABA对二酚酶的效应为可逆的非竞争性的抑制．抑制常数K1为0．94mmol／L．本得到的结果与苯甲酸和苯甲醛的效应进行了比较．     

4-氨基苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用机理研究

报道了4-氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid)对蘑菇酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活力的影响和抑制效应.结果表明,4-氨基苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用.导致单酚酶活力和二酚酶活力下降50 0%的抑制剂浓度(IC50)分别为0.35和0.30 mmol/L.4-氨基苯甲酸对单酚酶的迟滞时间有明显的延长效应,1.0 mmol/L可使单酚酶的迟滞时间从30.5 s延长到155.1 s.增加了4.4倍.4-氨基苯甲酸对二酚酶的抑制作用表现为混合型可逆抑制作用,抑制常数(Kl和Ks)分别为0.259和1.46 mmol/L.     

尿激酶B链的制备及性质研究

本文将巯基乙醇还原法与苯甲脒-Sepharose 4B亲和层析法相结合,于亲和柱上裂解了尿激酶蛋白的A、B链,制备出高纯度的尿激酶B链,活力回收达89.3％。样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为均一单带,测得分子量为32KD,比活为214×10~3iu/mg蛋白,活性的最适pH为8.0。在体外测活系统中,尿激酶B链有类似于尿激酶的性质。若以纤维蛋白溶酶原为底物,测得B链的Km值为尿激酶的3.2倍。由此推测,天然形成的尿激酶结构更有利于纤溶反应。     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B功能域及其全酶的原核表达及活性比较

通过设计引物,利用RT-PCR从人肝癌细胞(huh-7)中克隆蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)全长及功能域PTPc的cDNA序列并连接到pGEM-T Vector载体上,测序正确的cDNA序列连接到表达载体pET-32a(+)上,分别在大肠杆菌Transetta(DE3)和BL21(DE3)菌株中稳定表达目标蛋白,经Ni 2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,通过酶促动力学方法分析两种蛋白的体外活性.本实验成功表达了PTP1B和PTPc可溶性蛋白,并发现Transetta(DE3)菌株较BL21(DE3)有更高的蛋白表达能力;酶促动力学分析表明,PTP1B全酶的Vmax为16.13mmol·L-1·s-1,Km为0.94mmol/L;其功能域PTPc的Vmax为5.49mmol·L-1·s-1,Km为0.54mmol/L.表明PTP1B全酶的活性高于PTPc功能域的活性.     

熊猫豆β—D—半乳糖苷酶的基本性质研究

经硫酸铵分级分离,DEAE－cellulose 52,CM-cellulose 52和Sephacryl S 100HR凝胶过滤层析方法从熊猫豆黄化苗中获得了一种β－D－半乳糖苷酶,活性收率为8．0％,纯化倍数为245。经PAGE显示单一蛋白着色带,用IEF－PAGE测定其PI为4．1。SES－PAGE显示2条蛋白着色带,其相应分子量分别为40kD和29kD.Sephadex G200层析法测得表观分子量为68kD,以ONPG和PNPG为底物测得该酶的表观Km分别为3.02mmol/L和0．33mmol/L。最适pH为4．2,最适温度为52℃。以乳糖为底物测得表观Km为43mmol/L.HgCI2,DTNB,NEMI,半乳糖和乳糖对酶表现出不同的抑制作用。对某些金属离子和化学修饰剂对酶活性的影响也进行了探讨。     

水分胁迫对马铃薯出苗期根系生理特性及内源激素IAA、ABA含量的影响

采用盆栽试验,以马铃薯克新1号为供试材料,设置中度水分亏缺(T1)、重度水分亏缺(T2)、正常供水(CK)和水涝胁迫(T3)4个水分处理,研究了水分胁迫对马铃薯出苗期根系生理特性和内源激素含量的影响,探讨了土壤水分胁迫对马铃薯出苗期根系生长发育及其生理过程的影响机制.结果表明:(1)随着水分亏缺程度的加剧和时间的延长,根系活力、MDA含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、CAT活性和POD活性升高,在水分胁迫初期,根系中CAT、POD活性较SOD响应更敏感,表明胁迫前期主要依赖CAT、POD,后期通过CAT、POD和SOD共同作用来降低氧化伤害;水涝胁迫下,根系活力一直低于正常供水,MDA含量不断升高,可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、SOD活性、CAT活性和POD活性有先升高后降低的趋势,但不敏感;水分胁迫下,IAA含量降低,ABA含量升高,IAA/ABA比值降低,影响根系正常发育,影响吸收水分和养分、影响出苗.(2)IAA含量和可溶性蛋白含量呈极显著负相关,ABA含量与可溶性蛋白含量呈显著正相关,与CAT活性呈极显著正相关.研究表明,马铃薯出苗期根系通过对渗透物质、保护酶和内源激素的调节来维持自身的正常生理代谢功能,抵抗一定的水分亏缺,但亏缺加剧时,将严重影响马铃薯出苗.     

人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

人鼻病毒3C蛋白酶具有高特异性,且在低温条件下具有较高酶活,目前已被商品化.在大肠杆菌中利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签可促进人鼻病毒3C蛋白酶的可溶性表达.将人鼻病毒3C蛋白酶的DNA编码序列克隆到pRK792载体上,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,获得MBP-LEVLFQGP-6x His-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白,随后通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白.用该产物切割纯化的MBP-LEVLFQGP-6x His-木聚糖酶融合蛋白,可获得木聚糖酶并用底物平板检测其活性.实验结果表明人鼻病毒3C蛋白酶能够在大肠杆菌中表达,并且能特异性地在其底物识别序列进行切割,从而移除MBP标签,获得仅带有6x His的人鼻病毒3C蛋白酶.该酶可以特异性地去除木聚糖酶融合蛋白中的MBP标签,获得有活性的木聚糖酶.利用MBP标签能够促进人鼻病毒3C蛋白酶可溶性表达,且人鼻病毒3C蛋白酶的活性不受影响,有利于一些不稳定的蛋白在低温下的标签去除和纯化.     

野生革耳菌组成型漆酶的生成条件及性质研究

首次发现野生革耳菌 (Panusrudis)在 39℃液体振荡培养条件下 ,不需诱导剂的诱导 ,能持续产生漆酶 .优化后培养基的碳氮源分别为 2 %蔗糖和 2 6mM酵母抽提物 ,最高酶活达 1 .6× 1 0 4U/L ,属于目前已知的组成型漆酶高产菌株 .发酵液经硫酸铵沉淀 ,DEAE Sepharose ,SephacrylS 2 0 0 ,MonoQ柱层析分离纯化后 ,可得电泳纯漆酶蛋白 .该酶为单体蛋白 ,分子量为 58kDa .以愈创木酚为底物 ,该酶的最适作用pH为4 5,最适反应温度为 50℃ ,Km值为 0 .2 1mM ,并表现出较好的热稳定性 ,具有良好的基础研究和工业应用价值     

青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

尼罗罗非鱼肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是生物体内主要的溶酶体水解酶之一,广泛存在于动植物和微生物体内.以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏作为材料,采用硫酸铵(饱和度30%～70%)分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephadex G-200分子筛凝胶过滤柱层析的方法分离纯化NAGase,得到比活力为2 988U/mg的酶制剂.经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测呈现单一条带,说明所得酶为PAGE单一纯.通过Sephadex G-200柱层析法测得NAGase的总分子质量为61.8ku,结合SDS-PAGE结果,说明该酶仅有一个亚基.进一步测定了NAGase的酶学性质:NAGase水解底物对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)的最适温度为55℃,温度稳定范围为0～55℃,超过75℃时则完全丧失活性;NAGase水解底物的最适pH为5.8,pH稳定范围为4.0～9.0,pH大于9.0时几乎完全失活;该酶水解底物的动力学参数Km和vm分别为0.229mmol/L和9.346μmol/(L·min);运用化学修饰法分析发现二硫键、氨基、组氨酸咪唑基和色氨酸吲哚基均是NAGase的活性必需基团,而精氨酸胍基则不是其活性必需基团.