阴沟肠杆菌一个内切纤维素酶Cel8A的克隆和功能证实

【目的】为了解决纤维素的酶水解问题,分析能水解纤维素的微生物的相关基因。【方法】从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的基因组数据中挖掘纤维素酶相关基因,发现开放读码框Cel8A和纤维素酶基因序列具有高相似性。利用重组表达技术在大肠杆菌中对Cel8A基因进行表达,纯化重组蛋白质并对该蛋白质进行功能鉴定。【结果】Cel8A蛋白质能水解羧甲基纤维素钠,它具有β-1,4-内切葡聚糖酶的水解特性。Cel8A的最适反应pH值为7.0,最适温度为40℃。【结论】成功克隆表达阴沟肠杆菌的Cel8A基因,并证实该基因编码的蛋白质具有β-1,4-内切葡聚糖酶活性,为进一步研究阴沟肠杆菌的纤维素酶组成以及纤维素降解机理奠定了基础。     

极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表达和酶学性质的研究

极耐热酶在工业生产中有可观的潜在用途，为此从极端嗜热厌氧细菌海柄热袍菌中通过PCR方法克隆出Cel12B基因，构建重组表达质粒pET-20b-Cel12B，转化至大肠杆菌JM109（DE3）诱导表达后，获得极耐热重组内切葡聚糖酶．经过热处理和组氨酸亲和层析柱纯化，获得电泳纯单一条带，酶学性质测定表明：最适作用pH为6．0，最适作用温度90℃，在pH5．3～6.5之间酶活力稳定，90℃半衰期70min。     

降解结晶纤维素极耐热葡聚糖酶重组菌的构建

极耐热纤维素酶在纤维素生物转化中具有潜在的开发前景,但极耐热酶缺乏对天然纤维素的分解能力。采用基因工程方法,将极耐热内切葡聚糖酶Cel12B基因和同样极端嗜热菌来源的纤维素结合域(CBD)区域融合,构建重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD,转化至大肠杆菌JM109(DE3)诱导表达后,融合基因表达产物对结晶纤维素具有一定的分解能力。     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

绿木霉ZY-01中纤维素酶EGⅣ基因的克隆及其在E.coli中的原核表达

以前期筛选到的纤维素酶高产菌株绿木霉T.viride ZY-01的总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆出内切葡聚糖酶EGⅣ基因,连接至pET-28a构建出重组质粒,并转化至E.coli BL21(DE3)中表达。该EGⅣ基因约有1089bp,在启动子T7lac的控制和IPTG的诱导下,目的基因成功地在原核细胞中表达。通过SDSPAGE检测得出目标蛋白分子量为39kDa,重组酶的比酶活为1.05U/mg,该酶最适pH值为6、最适反应温度为50℃。     

一种灰盖鬼伞外切β-1,3葡聚糖酶基因的克隆与表达

为了简单快速地获取大量的β-1,3葡聚糖酶以研究其在真菌形态发生过程中所发挥的作用,本研究以灰盖鬼伞的c DNA为模板克隆了一种编码外切β-1,3葡聚糖酶的基因,并将该基因插入表达质粒p ET28A(+)中,获得了重组表达质粒p ET28A(+)-exg,转化到E.coli Rosetta菌株中并进行异源重组表达.结果显示,克隆基因的c DNA全长2 415 bp,共编码786个氨基酸;SDS-PAGE电泳表明该基因在E.coli Rosetta菌株中得到了高效表达,重组表达的酶蛋白表观分子量为85 k Da;纯化后获得的表达酶经DNS法测得比活力为45 U/mg.酶学性质测定结果表明,该酶具有β-1,3葡聚糖外切酶活性,以昆布多糖为底物时,最适反应条件为p H 6.0、温度60℃,且有一定的耐热能力和较好的p H稳定性,具有较好的应用前景.     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

棘孢木霉GH11家族木聚糖酶的异源表达及酶学性质

从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)中克隆得到一个糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)11家族木聚糖酶基因TaXyn11A,并在大肠杆菌中进行了异源表达。该基因含有一个672bp的开放阅读框,编码223个氨基酸,编码的蛋白与来自哈茨木霉C4(Trichoderma harzianum)的GH11家族木聚糖酶xynⅡ(NCBI accession No. B5A7N4.1)的同源性为85.2%。粗酶液经Ni-NTA亲和层析一步纯化得到电泳级纯酶(TaXyn11A),该酶分子质量为24.2kDa。研究了纯酶的酶学性质,结果表明:TaXyn11A为酸性中温木聚糖酶,最适pH值和最适温度分别是5.0和50℃,在pH值为4.0~10.0时和45℃及以下保持稳定,45℃时半衰期为14.3h。EDTA、Mn²⁺和Cr³⁺对该酶有激活作用,而SDS和CTAB对该酶有抑制作用。底物特异性及水解特性分析表明:TaXyn11A可特异性水解燕麦木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、榉木木聚糖和桦木木聚糖等木聚糖底物,比酶活力分别为989.6、727.6、706.0、484.5U·mg-1,水解12h后,产物以聚合度为2~6的低聚木糖为主。这些优良的酶学特性使TaXyn11A在低聚木糖生产中具有潜在应用价值。     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

流加培养重组大肠杆菌表达核糖核酸酶Ba

核糖核酸酶Ba(barnase)是一种产自解淀粉芽孢杆菌的胞外核糖核酸酶,具有强毒性,能降解RNA,在农业、医疗、制药等领域有广泛的应用前景.利用重组表达barnase的大肠杆菌为研究对象,以期使用kil基因改善分泌状况,并实现大肠杆菌的高密度培养以及蛋白的高产表达.通过把kil-Km分泌盒克隆入质粒载体pET-32a(+)-barnase-barstar使barnase更加容易分泌与纯化,并使用Riesenberg培养基对重组大肠杆菌发酵生产barnase的不同葡萄糖浓度底物反馈控制补料流加策略进行了研究.初步确定1.0 g/L葡萄糖底物反馈流加时,获得的barnase酶活最高,为7.14 kU/mL,是文献报道的1.88倍,此时细胞干质量浓度为22.93 g/L,其中细胞间质的酶活达到3.53 kU/mL.为今后的发酵bar-nase研究提供了参考.     

α-1,6-葡聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

根据朱黄青霉(Penicillium minioluteumHI-4)α-1,6-葡聚糖酶的基因序列,人工合成α-1,6-葡聚糖酶基因并将其插入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA,PCR和双酶切验证结果均表明成功构建了重组质粒pPICZαA-Dex.重组质粒经SacⅠ线性化后整合到毕赤酵母X33基因组中进行表达.摇瓶发酵表明,重组毕赤酵母经甲醇诱导120 h产酶活力达到最高值29.2 U/mL,SDS-PAGE结果显示在67 ku附近有明显的条带,与α-1,6-葡聚糖酶理论分子质量相符合.     

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以pET-22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过PCR成功克隆到该菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侣基因(lipPA-9B),并构建共表达重组质粒pET22b-lipPA-9A-9B,实现脂肪酶LIP-9A的活性表达。酶学性质研究表明LIP-9A的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNPO);同时,LIP-9A还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。     

产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化

以非解朊栖热菌HG102基因文库筛选的重组质粒pUC18-atgly为模板PCR扩增α-葡萄糖苷酶结构基因,与表达载体pET28α(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.对重组菌的产酶条件进行了初步优化,最终酶活由4.25U/mL提高到40.85U/mL.     

大米草半纤维素选择性酶解研究

采用由东方肉座菌EU7-22表达的重组木聚糖酶HoXyn11A、黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖酶AnXyn10C和商品木聚糖酶分别降解大米草半纤维素,探索其降解的最佳工艺条件,结果发现该3种木聚糖酶最适pH值为4.5～5.5,最佳反应温度为45～55 ℃,酶用量为200～300 IU·g^-1底物,反应时间为12～24 h.对比结果表明:通过黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖AnXyn10C能够在24 h内基本将大米草半纤维素降解为低聚木糖,效率远高于商品酶和东方肉座菌EU7-22表达的重组木聚糖酶HoXyn11A.黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖AnXyn10C是大米草半纤维素降解酶的良好来源.     

绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。     

Klebsiella sp.GXK-1的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

【目的】克隆、表达克雷伯氏菌Klebsiellasp.GXK-1菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,并研究重组酶的酶学性质。【方法】比对分析GenBank数据库中克雷伯氏菌同属的α-L-鼠李糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因的保守区。扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-rha1,并在大肠杆菌E.coli XL-blue进行诱导表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究目的蛋白RHA1的酶学性质。【结果】以pNPR为底物,进行重组酶酶学性质的研究。重组酶RHA1的最适pH值和最适温度分别为5.0和45℃,Km值为(0.223±0.030)mmol/L,V_(max)值为(1.272±0.121)μmol/(min·mg)。在pH值为6~10的缓冲液内酶活力仍保持在80%以上;在温度为40℃以下时,酶活较为稳定,但在温度高于40℃时酶活力迅速下降。RHA1能水解pNPR、橙皮苷和芦丁。【结论】RHA1具有良好的pH稳定性,不仅能够水解人工底物pNPR,还能够水解α-1,6键的天然底物橙皮苷和芦丁,具有一定的医疗应用价值。     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶RuAra1的表达与鉴定

随着能源问题的日益突出,半纤维素资源的利用逐渐受到人们的重视.α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Larabinofuranosidase,EC 3.2.1.55)属于半纤维素酶系,能水解以α-1,3、α-1,2或α-1,5键连在木聚糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚阿拉伯糖侧支.本实验室将克隆得到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因RuAral在大肠杆菌中重组表达,得到的重组阿拉伯呋喃糖苷酶RuAral能够水解4-硝基酚-α-L-阿拉伯糖苷(4-Nitrophenyl-α-Larabinofuranoside,pNPA)、4-硝基酚-β-D-吡喃木糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,pNPX)以及从小麦阿拉伯木聚糖中水解释放阿拉伯单糖.以pNPX为底物时,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃.RuAral与瘤胃真菌(Neocallimastix patriciarum)内切木聚糖酶XynCIDBFV、瘤胃细菌木糖苷酶RuXynl的组合使用可以实现对小麦阿拉伯木聚糖的协同降解,且降解效率优于德国AB酶制剂公司的商品酶ROHALASE WP.