马铃薯病毒一步法RT-PCR诊断研究

运用一步法RT-PCR对马铃薯和烟草中的马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒进行了检测,实验表明:对酚-SDS方法提取的病毒核酸进行扩增,一步法RT-PCR检测到的扩增产物的灵敏度较两步法RT-PCR的高100倍左右.两种提取方法对比,用一步法RT-PCR进行扩增,检测到的PEG法扩增产物的灵敏度较酚-SDS法扩增产物的灵敏度高3倍.建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的马铃薯病毒一步法RT-PCR检测技术.     

马铃薯卷叶病毒RT-PCR-RFLP的检测分析

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)是马铃薯生产上的主要病毒病原之一,侵染马铃薯后,造成减产和品质退化.采自云南、内蒙古和贵州的马铃薯样品经过DAS-ELISA检测为PLRV阳性,经RT-PCR扩增出约350 bp的DNA片段表明感染了马铃薯卷叶病毒.进一步用HaeⅢ和StuⅠ限制性内切酶对马铃薯卷叶病毒的RT-PCR产物进行Restriction fragment length polymorphism (RFLP)分析,RFLP图谱与预期图谱相符.证实RT-PCR-RFLP方法是1种快速、准确的检测方法.     

马铃薯卷叶病毒陕西分离物外壳蛋白(CP)的生物信息学分析

目的分析预测马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白的理化性质及结构。方法应用DNA-MAN软件、ExPASy中的ProtParam工具,SignalP,LipoP程序,TMHMM,PSIPRED和3D-PSSM等方法,分析PLRV.CP的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亲疏水性、可溶性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、保守区域、三级结构等。结果陕西PLRV.CP,与已报道的PLRV.CP高度同源。蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,不属分泌蛋白,是可溶的亲水性蛋白。二级结构主要为折叠和无规则卷曲,不含转角。三级结构保守区预测表明,该蛋白属于黄化病毒属外壳蛋白成员。结论对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白的生物信息学分析为进一步研究其功能、探索抗病途径奠定了基础。     

JD病毒基因组片段的克隆和序列分析

扩增并克隆了ＪＤ病毒的ｇａｇ 基因片段（位于３００ｎｔ～５６４ｎｔ,编码基质蛋白ＭＡ）和ｐｏｌ基因片段（位于３４６７ｎｔ～３６９１ｎｔ,编码反转录酶ＲＴ）,测定其序列并同ＢＩＶ、ＢＦＶ 和ＢＬＶ 的相应基因进行比较．所建立的方法能够特异性扩增ＪＤＶ序列,适用于ＪＤＶ的检测     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变酶的克？…

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的锤头状核酶，设计、合成了编码与其相应的突变核酶的ｃＤＮＡ，并克隆到质粒ｐＧＥＭ－４Ｚ中，经序列分析及体外转录表明得到寒带的突变核酶基因重组质粒，从而为突变核酶的转基因及进上频琛麦在转基因马铃薯中表达引韦的抗性及机理创造的条件。     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因3′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得的ORF2a的3′端1kb cDNA克隆于pUCl9中，构建成重组质粒pLR7，经PCR检测、酶切检测，表明获得了ORF2a的3′端1kb cDNA克隆．从两端进行了两次序列分析，将获得的核苷酸序列与国外报道的四个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较．结果表明它们具有高度同源性．文中对核苷酸中存在的可能移码序列及其下游的茎环结构(或假节结构)，以及上游特征性三次重复序列进行了分析和讨论，发现上游特征性三次重复序列连续排列可形成几个连续的互补双链区和发夹结构，这一结构可能与移码有关．     

逆转录聚合酶链式反应快速检测水稻条叶枯病毒

逆转录聚合酶链式反应（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ－ＰＣＲ）具有灵敏度高,准确性好的特点,因而被广泛应用于植物病毒检测。在ＲＴ反应中,ＲＮＡ样品的快速制备尤为重要用异丙醇二步沉淀法获得ＲＮＡ,快速检测水地片中ＲＳｔＶ伯ＲＴ－ＰＣＲ方法,可使测定时间缩短至６ｈ,并可从０．０７８ｍｇ感病叶片中检测出ＲＳｔＶ。     

PCR检测白血病患者外周血中EB病毒的DNA

目的：了解白血病患者ＥＢ病毒感染情况。方法：收集２１例急性淋巴细胞白血病、１例慢性淋巴细胞白血病、１５例急性粒细胞白血病、８例慢性粒细胞白血病患者及３２例正常对照组的外周血,分离单个核细胞,提取ＤＮＡ,应用ＰＣＲ方法检测ＥＢ病毒ＤＮＡ。结果：在１例初诊慢性粒细胞白血病病人样本中发现ＥＢ病毒阳性,余均为阴性。结论：白血病患者存在ＥＢ病毒感染情况,但并不普遍。     

对虾桃拉病毒(TSV)RT-PCR快速诊断技术的研究

对虾桃拉病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)最早于1992年在凡纳对虾(Penaeus vannamei)体内发现，此病毒是对虾养殖业危害较严重的病毒之一．将该病毒基因组的一段序列克隆至转录载体pSP64(PolyA)上。经体外转录、磁珠法分离、纯化获得了人工的TSV-RNA模板；用定量的TSV-RNA阳性对照模板进行RT-PCR条件优化。灵敏度检测以及样品制备方法等试验，结果表明：RT-PCR检测的灵敏度可达到0．1fg，相当于100个病毒粒子；所制备的样品对病毒RNA的逆转录及扩增无抑制，适合于对虾桃拉病毒快速检测．     

多重PCR法快速鉴定转基因小麦植株及后代

根据转基因植物中常用的报告基因uidA、选择基因bar的序列,设计合成两对不同的引物,建立了在转基因小麦材料分子确证中,应用一次PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的多重PCR方法．通过对质粒pAHC25以及30个转基因小麦样品进行PCR扩增分析,比较多重PCR的检测结果与单基因的PCR扩增结果,发现两者结果完全一致．     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆及体外转录

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株 ( PLRV-Ch)复制酶基因负链 RNA的锤头状核酶 ,设计、合成了编码与其相应的突变核酶的 c DNA,并克隆到质粒 p GEM-4 Z中 ,经序列分析及体外转录表明得到完整的突变核酶基因重组质粒 ,从而为突变核酶的转基因及进一步研究核酶在转基因马铃薯中表达引起的抗性及机理创造了条件     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

大肠杆菌（Escherichia coli）甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆

用聚合酶链式反应扩增了大肠杆甜菜碱醛脱氢酶基因，插入ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的Ｘｂａｌ和ＫｐｎＩ位点后转化大肠杆菌，得到了克隆，并亚克隆在植物双元表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，通过ＰＣＲ得到证实。     

用聚合酶链式反应扩增抗冻肽基因并在双元表达载体中克隆

抗冻肽基因导入植物的第一步合成了５＇－末端分别带有限制性酶ｘｂａＩ和ＫｐｎＩ识别位点的一对引物，以美洲拟鲽抗冻肽的ｃＤＮＡ克隆为模板，用锚定聚合酰酶链反应扩增了抗冻肽基因，并克隆到细菌表达载体ｐＧＥＭ３２ｆ（一）和植物表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，以限制性酶切分析和菌落杂交技术证明了转化子质粒ＤＮＡ中的含有抗冻肽基因，又用ＰＣＲ方法扩增了转化子的抗冻肽基因，从而证实了克隆成功。     

潜隐病毒对苹果（Malus pumila）无机和有机营养状况的影响

分别对携带和不携带3种苹果潜隐病毒(ACLSV、ASPV、ASGV)的乔纳金(Jonagold)、新红星(Redchief)和长富-2(Fuji)3个苹果品种结果树的水分、无机营养和有机营养水平进行了测定,测定结果表明,携带和不携带3种苹果潜隐病毒的苹果结果树的水分、无机营养和有机营养状况有着不同程度的差异,无毒树叶片的含水量、含氮量和可溶性蛋白含量均显著高于带毒树,而带毒树的含钙量则显著较高,无毒树的可溶性糖和淀粉比例与带毒树有明显不同。     

利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA（Reteplase）

构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）的烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus,TMV）瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（western blotting）和纤维蛋白琼脂糖平板（fibrin-agarose plate assay,FAPA）法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径.