利用重组大肠杆菌生产聚-3-羟基丁酸的研究

利用携带能合成聚-3-羟基丁酸的基因的大肠杆菌E. coli XL1-Blue,优化培养基和培养条件后,进行了补料分批培养.结果表明,重组大肠杆菌E. coli XL1-Blue(pKSS105)的最适培养基为R培养基.在最佳条件下,以葡萄糖为唯一碳源培养工程菌60h后,发酵液中菌体干重达183g/ L,P(3HB)的产量为133.8g/ L,P(3HB)含量为73.1%.实验结果为P(3HB)实际应用提供了可能性的基础.     

利用溶氧作为控制信号补料分批培养生产PHA的研究

利用已构建的工程菌Escherchia coli XL1-Blue(pKSABC),在20L自动发酵罐里进行补料分批培养。研究表明,底物浓度、温度、pH、DO等参数是影响菌体生长和PHA积累的重要因素;通过补料分批培养可以提高PHA的积累量。通过对DO在发酵过程中的变化规律的分析,确定DO作为补料时间的在线控制信号。补料的原则是,使发酵前期菌体大量生长,发酵后期PHA大量积累。在优化条件下,对工程菌Escherchia coliXL1-Blue(pKSABC)进行了60 h的补料分批培养,菌体浓度、PHA浓度和PHA占细胞干重的百分比分别为179g/L,132g/L,73.7%。     

金黄色葡萄球菌isdB基因克隆、表达及其抗原性鉴定

为了构建含牛源金黄色葡萄球菌isdB基因的原核表达载体,并确定其在大肠杆菌表达系统中的表达效果,应用PCR方法扩增出osdB基因片段与原核表达载体pQE-30,构建了重组原核表达载体pQE-30-isdB,将该重组载体转化至E.coli XL1-Blue中诱导表达蛋白.经SDS-PAGE和Westem blot鉴定,P...     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L–组氨酸生物合成途径,以提高L–组氨酸的产量.用NTG诱变大肠杆菌M-17(SGr),依次赋予其2–噻唑丙氨酸(2-TA)和组氨酸氧肟酸盐(HisHx)遗传标记,再以突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his-operon,将重组质粒导入突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)得到工程菌E.coli M-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pUC118-his-operon).根据zwf和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E.coli M-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L–组氨酸的产量.摇瓶发酵结果显示,L–组氨酸产量与对照株相比,工程菌E.coli M-19提高了4.5倍,双质粒系统重组工程菌E.coli MZH-19、E.coli MPH-19和E.coli MZPH-19分别提高了5.14、5.78、8.43倍.     

诺卡氏菌腈水合酶突变基因在重组大肠杆菌中的高活性表达

为了提高腈水合酶基因的重组表达水平,提出了3种基因策略:在重组大肠杆菌中共表达激活子序列、在重组毕赤酵母中表达以及对α亚基的起始密码子进行定点突变。结果表明:对α亚基的起始密码子进行定点突变的基因策略为最佳方案,突变后的腈水合酶基因在重组E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAM)中表达时,腈水合酶的比酶活(以干菌质量计)提高到51 U/mg。进一步以pET28a为载体,插入突变后的腈水合酶基因,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETNHM。对优选菌株进行培养条件和诱导条件的优化,腈水合酶的最高比酶活达到450 U/mg。     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

谷胱甘肽合成酶系基因协调表达体系的构建

通过 PCR获得 E.coli B谷胱甘肽合成酶系基因 ( gsh I,gsh II)片段 ,结合定点突变稀有起始密码子 ,设定 gsh I与 gsh II位置与距离 ,构建双顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I- gsh II,建立GSHI、GSH- II蛋白表达体系。结果表明 :以 0 .0 8mmol/L IPTG于 2 8℃诱导工程菌 E.coli BL2 1( DE3) ( p Trc99A/gsh I- gsh II) ,GSH- I、GSH- II蛋白比为 4.5∶ 1 ( m∶ m)时谷胱甘肽合成能力最高 ,达到每克湿菌体 8.5 mg。通过构建单顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I、p Trc99A/gsh II测定GSH- I与 GSH- II蛋白的最适配比 ,结果表明 :在 GSH- I、GSH- II蛋白总量恒定的情况下 ,要提高谷胱甘肽产率 ,两者比例以 3∶ 1～ 6∶ 1为宜     

重排NAD+合成途径提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性

为提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的催化活性,构建了两个载体分别表达:(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);(2)与NAD+合成相关的关键酶,包括烟酸转磷酸核糖激酶(pnc B)、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(nad D)和NAD+合成酶(nad E)。将这两个载体共转化大肠杆菌,获得重组菌E.coli(p ET-pepcp UC-pnc B-nad D-nad E)。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示这些酶均实现了高表达。摇瓶发酵显示,与单独过表达PEPC的重组菌相比,双质粒工程菌的PEPC酶活提高了4.36倍;与野生型大肠杆菌相比,双质粒工程菌的琥珀酸产量提高了4.23倍,达到0.9 g/L,富马酸产量提高了5.23倍,达到5.4 mg/L。上述结果表明加强NAD+合成途径提高了PEPC活性,并增加了还原三羧酸循环的代谢流量。     

生物转化法重组谷氨酸脱羧酶合成γ-氨基丁酸

成功构建了一个高效表达大肠杆菌谷氨酸脱羧酶GAD来源的重组质粒pET28a-gadA,并转化E.coli BL21(DE3),工程菌株经0.4mmol/L IPTG或1g/L的乳糖, 37℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到12U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的60倍.工程菌1.15U粗酶液以31g/L L-谷氨酸钠为底物, 37℃、pH 4.0条件下反应4h,γ-氨基丁酸的生成量达到19.57g/L, L-谷氨酸钠的转化率为93%,从而为γ-氨基丁酸的生产提供了很好的前景.     

抗CPAα毒素单链抗体基因的克隆和表达及其生物学特性研究

应用RT—PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌 (CPA)α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其定向克隆于表达载体 pHOG2 1中 ,构建重组表达载体 pHOG 2E3,转化至大肠杆菌XL1 Blue中 ,筛选出表达菌株XL1 Blue(pHOG 2E3)。SDS PAGE分析结果表明 ,在 2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %,ScFv蛋白主要以包涵体的形式存在 ,但在胞周质和培养上清中也能检测到ScFv蛋白 ,其中在胞周质中表达的ScFv蛋白占菌体可溶性蛋白的 4 %。生物学试验结果表明 ,ScFv基因表达产物不仅能够中和α毒素的磷酯酶C活性 ,而且对攻击致死剂量α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在荧光假单胞菌中的表达

将已克隆到的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)C-2的几丁酶基因chi1片段克隆到质粒载体pUXBF5中，得到重组质粒pUXCH1，该重组质粒在大肠杆菌中可以表达产生具有生物活性的几丁酶并分泌到胞外。将pUXCH1分别利用感受态法和三亲本杂交法转化荧光假单胞菌（Psendomonas fluorescens），在含有卡拉霉素的金氏B平板上筛得转化子。但将转化子点种于几丁质平板上却不能产生水解圈，提取细胞内容物后用比色法也没有检测到有效的酶活性。该研究表明环状芽孢杆菌 的几个酶基因chi1已经被成功的整合到荧光假单胞菌的染色体上，但却没有表达或表达效率极低，这可能是由于荧光假单胞菌的表达系统不能正确有效的识别存在于该chi1几丁酶基因片段中的环状芽孢杆菌基因启动子而造成的。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组细菌双杂交系统的构建

细菌双杂交系统是新近建立的一种研究蛋白质间相互作用的方法.应用细菌双杂交系统,分别以pBT、pTRG诱饵质粒构建编码WSSV基因组DNA随机片段的融合表达质粒pBT-wssv、pTRG-wssv.重组质粒共转化双杂交报告菌株XLl-Blue MRF′,通过LB-TCK平板筛选对虾白斑综合征病毒中有相互作用的蛋白质.本研究中我们构建了WSSV基因组细菌双杂交系统,用于筛选WSSV中有相互作用的蛋白,为该病毒功能基因组的研究打下良好的基础.     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

高效电转化率条件的探索

对影响ＤＮＡ电转化效率的主要因素进行探索,结果表明：在相同的电场强度、电阻入电容条件下,电中时间的长短对电转化交谊级较大影响,电脉冲时间太长或太短均使转化效率降低;用对数生长早中期的细菌制备感受态细胞,经液氮速冻后储存于－７０℃,能获得高转化效率。     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.