孤独谱系障碍相关基因dia1r斑马鱼突变体的构建及行为学表型探析

dia1r基因是人类孤独症谱系障碍相关基因.临床研究发现,缺失dia1r可能会导致患者面部畸形、智力障碍和语言发育迟缓等症状.目前,对dia1r基因的功能及分子机制知之甚少,仅有少数在鸡胚、斑马鱼、小鼠中的表达定位研究.本文通过CRISPR/Cas9系统构建了dia1r敲除的斑马鱼突变体模型,成功获得了稳定遗传的纯合突变体.对突变体进行行为分析发现,与野生型斑马鱼相比,纯合突变体幼鱼的自发运动能力降低,趋触性减弱,对光暗交替刺激更加敏感.在成鱼社交偏好实验中发现,雄性纯合突变体比野生型表现出较弱的社交偏好.     

微注射人TCP10L基因对斑马鱼形态的影响

利用模式生物斑马鱼,通过微注射的方法,研究了人肝脏特异性转录因子TCP10L对斑马鱼早期胚胎发育的影响.结果显示:人TCP10L基因对斑马鱼胚胎发育有一定的毒性.表现为早期的脊索发育异常,个体严重畸形;当血液循环出现后,表现为血流延缓和围心腔水肿等症状.该项研究表明:人肝脏特异性转录因子TCP10L在斑马鱼胚胎中的过表达会引起显著的形态异常和心血管障碍,并且这种影响与其是否在斑马鱼肝内的特异表达有关,为进一步探明该转录因子在人肝脏内发挥的功能奠定了基础.     

微注射入TCP10L基因对斑马鱼形态的影响

利用模式生物斑马鱼,通过微注射的方法,研究了人肝脏特异性转录因子TCP10L对斑马鱼早期胚胎发育的影响.结果显示：人TCP10L基因对斑马鱼胚胎发育有一定的毒性.表现为早期的脊索发育异常,个体严重畸形;当血液循环出现后,表现为血流延缓和围心腔水肿等症状.该项研究表明：人肝脏特异性转录因子TCP10L在斑马鱼胚胎中的过表达会引起显著的形态异常和心血管障碍,并且这种影响与其是否在斑马鱼肝内的特异表达有关,为进一步探明该转录因子在人肝脏内发挥的功能奠定了基础.     

CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼park2基因的定点敲除

作为目前最新、最先进的基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统为分子细胞生物学带来革命性发展,以它的简单高效、灵活性以及可实现DNA序列的定向突变而被广泛使用.斑马鱼的park2基因位于第13号染色体上,编码的Parkin蛋白是一个E3泛素连接酶.该基因在斑马鱼中的功能还不清楚.利用CRISPR/Cas9系统,首次在斑马鱼胚胎中实现了park2基因的大片段删除.由于斑马鱼在发育和疾病研究中有很大优势,实现park2基因敲除将有助于将来进一步研究该基因的功能.     

多种环境雌激素低剂量联合处理诱导斑马鱼精子发生障碍

用E2、EE2、DES、4-t-OP、4-NP、BPA等6种环境雌激素暴露雄性斑马鱼(Danio rerio)成鱼120d。对暴露后斑马鱼精巢的组织学观察发现,其中精子的发生被明显抑制,精子大量丢失,出现空腔;早期生殖细胞大量增生。采用半定量RT-PCR对暴露后斑马鱼精巢发育和精子发生相关基因的表达进行研究,结果表明联合处理后,斑马鱼精巢中雄激素合成酶基因P450 11β、cyp17a1的表达显著下调(p0.05),而孕激素合成酶基因20β-hsd和雌激素合成酶基因cyp19a1a的表达量没有显著变化,但雌激素受体基因esr1的表达则显著上调(p0.05);减数分裂标记基因dmc1没有显著变化,而scp3基因的表达则显著下调(p0.05)。另外,视黄酸(Retinoic acid,RA)合成酶基因aldh1a2的表达显著上调(p0.05),而RA降解酶基因cyp26b1的表达则无显著变化。研究推测多种环境雌激素的联合处理可能通过下调雄激素合成酶的表达、上调雌激素效应和增强减数分裂起始并抑制减数分裂后期过程诱导斑马鱼成鱼精子发生障碍;因此多种环境雌激素低剂量联合暴露对渔业资源造成的生殖风险值得警惕。     

斑马鱼crip2基因的克隆、亚细胞定位及在胚胎发育早期的表达分析

斑马鱼广泛用于脊椎动物遗传和发育生物学的研究．为揭示包含具有LIM结构域的crip基因的功能,本文以斑马鱼为实验对象,克隆了斑马鱼的crip2基因,分别构建了crip2-Teasy 和crip2-egfp载体,从含有crip2基因的crip2-Teasy质粒上转录crip2 RNA 探针,并用全胚胎原位杂交法检测crip2在斑马鱼胚胎中的表达,用crip2-egfp对crip2进行亚细胞定位研究,发现crip2基因在斑马鱼胚胎早期没有表达,五体节开始在脊索特异表达;后期,主要局限于在血管、心脏和体节间肌肉,表明crip2的表达并不局限于内皮系统．在细胞内,crip2基因在细胞核和胞浆中均有表达．这些工作为进一步研究crip2基因的功能奠定了基础．     

镉对转基因斑马鱼的急性毒性效应

采用转基因斑马鱼T_g(lyz:EGFP)-Lyz fish为模型,探讨了重金属镉对转基因斑马鱼的胚胎毒性和免疫毒性.结果表明,相比空白对照组,0.1μM和1μM CdCl_2对斑马鱼胚胎产生一定的毒性影响,并促进溶菌酶(lysozyme C,lyz)标记的斑马鱼体内的中性粒细胞的荧光表达.随着CdCl_2浓度的增加,24 h血流障碍、56 h死亡数和56 h孵化抑制等指标均呈现递增趋势;在CdCl_2诱导下的斑马鱼仔鱼体内的中性粒细胞增多并向发生炎症部位分布,主要趋向于肝脏部位聚集.因此,本研究对转基因斑马鱼在环境污染物的免疫毒性检测方面有着重要意义.     

多种环境雌激素低剂量联合处理诱导斑马鱼精子发生障碍

用E2、EE2、DES、4-t-OP、4-NP、BPA等6种环境雌激素暴露雄性斑马鱼(Danio rerio)成鱼120 d。对暴露后斑马鱼精巢的组织学观察发现，其中精子的发生被明显抑制，精子大量丢失，出现空腔；早期生殖细胞大量增生。采用半定量RT-PCR对暴露后斑马鱼精巢发育和精子发生相关基因的表达进行研究，结果表明联合处理后，斑马鱼精巢中雄激素合成酶基因P450 11β、cyp17a1的表达显著下调(p<0.05)，而孕激素合成酶基因20β〖KG0.01mm〗-hsd和雌激素合成酶基因cyp19a1a的表达量没有显著变化，但雌激素受体基因esr1的表达则显著上调(p<0.05)；减数分裂标记基因dmc1没有显著变化，而scp3基因的表达则显著下调(p<0.05)。另外，视黄酸(Retinoic acid，RA)合成酶基因aldh1a2的表达显著上调(p<0.05)，而RA降解酶基因cyp26b1的表达则无显著变化。研究推测多种环境雌激素的联合处理可能通过下调雄激素合成酶的表达、上调雌激素效应和增强减数分裂起始并抑制减数分裂后期过程诱导斑马鱼成鱼精子发生障碍；因此多种环境雌激素低剂量联合暴露对渔业资源造成的生殖风险值得警惕。
     

伽马辐照对斑马鱼胚胎谷胱甘肽还原酶活性及基因表达的影响

谷胱甘肽还原酶(GR)是一种重要的抗氧化酶,其在生物体的抗氧化系统中起着关键作用.为了研究伽马辐照对斑马鱼胚胎GR活性及基因表达的影响,本实验用不同的辐照剂量(0.01、0.05、0.1、0.5和1 Gy)分别对三个发育时期(原肠胚期、体节期和咽囊期)的斑马鱼胚胎进行了辐照处理.分析了各组GR的活性,并采用荧光实时定量PCR技术(qRT-PCR)检测了GR基因的表达水平.结果显示,伽马辐照以剂量依赖的方式调整了斑马鱼胚胎GR的活性及GR基因的表达.随着辐照剂量的增加,GR活性及其mRNA的相对表达量呈现先升高后回落的趋势.这表明,GR是一种可以对伽马辐照作出早期预警的生物标志物.斑马鱼胚胎可以通过上调GR基因的表达,来增加GR的合成,从而提高对伽马射线的防御能力.但是,这种反应和调整是有限度的.咽囊期胚胎比其它两个时期的胚胎对伽马射线的防御能力更强.     

文昌鱼Pax1/9基因上游调控区的克隆及分析

脊椎动物Pax1/9是一重要的发育调控基因亚家族,文昌鱼基因组中仅有单一的该亚家族直系同源基因Amphi-Pax1/9,为检验此基因上游调控元件的功能在脊椎动物体内是否具有通用性,将文昌鱼Pax1/9基因上游约4.6 kb的侧翼序列与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因连接,构建重组质粒表达载体(pAmphiPax1/9-AcGFP),显微注射斑马鱼胚胎,并以斑马鱼Pax1和Pax9的上游同源序列为阳性对照.结果表明,阳性对照斑马鱼胚胎中GFP能够表达,但注射pAm-phiPax1/9-AcGFP质粒的斑马鱼胚胎中无明显的GFP表达,这一现象可能是由于Pax1/9上游调控序列在二物种间存在较大的进化差异,启动元件具有物种特异性.     

斑马鱼SAA基因克隆及表达分析

利用巢式PCR(nest PCR)的方法克隆斑马鱼血清淀粉样蛋白A基因,并进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR结果显示:SAA在斑马鱼胚胎发育时期的表达量呈现明显的“增长—稳定—增长”趋势.成鱼组织分布中,SAA在11个斑马鱼组织中均能检测到,在心脏和肝脏中相对高表达.     

斑马鱼在人类疾病模型以及药物筛选中的应用

小鼠作为研究人类疾病的动物模型已被广泛使用,然而其在大规模遗传筛选和药物筛选方面受到诸多限制.斑马鱼作为典型的脊椎动物,在器官水平和细胞水平上与哺乳动物相似,而且胚胎和幼体的透明特性为实时观察提供了方便;其基因与人类有很高的同源性且易于进行基因操作,因而成为了研究人类疾病的理想动物模型.本文介绍了斑马鱼在人类疾病模型和药物 筛选中的研究概况.     

二噁英污染引起的特异性下颌短小—斑马鱼下颌形态学检测

以二英为主的持久性环境污染物质具有强力的致癌、致畸性、致死性,对人类和动物的健康构成了严重的威胁.本实验使用其中毒性最强的环境污染物质2,3,7,8-四氯-二苯基-对-二英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,以下略为TCDD)作为标准对斑马鱼胚胎进行了染毒.实验结果表明TCDD可以引起斑马鱼下颌的短下,并且这种短小是以TCDD的浓度为依存的,通过原位杂交试验表明TCDD引起斑马鱼下颌短小与goosecoid基因以及与形态发育密切相关的ptd基因表达欠缺.因此本试验预示TCDD引起的下颌短小是特异性的,以下颌的短小作为TCDD对斑马鱼形态学发育影响的一种评价指标是有可行性的.     

二(口恶)英污染引起的特异性下颌短小-斑马鱼下颌形态学检测

以二(口恶)英为主的持久性环境污染物质具有强力的致癌、致畸性、致死性,对人类和动物的健康构成了严重的威胁.本实验使用其中毒性最强的环境污染物质2,3,7,8-四氯-二苯基-对-二(口恶)英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,以下略为TCDD) 作为标准对斑马鱼胚胎进行了染毒.实验结果表明TCDD可以引起斑马鱼下颌的短下,并且这种短小是以TCDD的浓度为依存的,通过原位杂交试验表明TCDD引起斑马鱼下颌短小与goosecoid基因以及与形态发育密切相关的ptd基因表达欠缺.因此本试验预示TCDD引起的下颌短小是特异性的,以下颌的短小作为TCDD对斑马鱼形态学发育影响的一种评价指标是有可行性的.     

nestin启动子驱动微管蛋白-EGFP载体的构建及其在神经干细胞中的应用

目的:构建巢蛋白nestin启动子驱动的微管蛋白表达载体,并在斑马鱼及大鼠神经干细胞中正确表达,为实现神经干细胞/神经前体细胞中微管骨架的动态观察和研究提供工具.方法:设计引物扩增斑马鱼基因组DNA中nestin基因上游启动子-952 bp片段并克隆测序;通过PCR获得斑马鱼EGFP-α-Tubulin融合蛋白序列,构...     

腺苷二磷酸诱导斑马鱼血小板聚集的初步研究

腺苷二磷酸（adenosine diphosphate,ADP）是有效的血小板激活剂。本文研究了腺苷二磷酸对斑马鱼存活率、血小板聚集和血栓相关基因血管性血友病因子（Von Willebrand Factor,vWF）的影响。结果显示,30μmol／L-1 mmol/L ADP对Sdpr（days post fertilization）斑马鱼存活率的抑制作用呈剂量和时间依赖性。利用血小板标记荧光的转基因斑马鱼,我们发现ADP也能诱导斑马鱼血小板聚集。反转录PCR（RT-PCR）结果显示vWF在斑马鱼血小板聚集过程中表达上调。说明ADP是研究斑马鱼血小板聚集机制的有利工具。     

斑马鱼Cyclin C的cDNA克隆及其在发育过程中的表达

细胞周期蛋白C(cyclin C)与细胞周期依赖性蛋白激酶cdk8结合,通过磷酸化RNA 聚合酶 II 和 TFIIH调控转录.在脊椎动物胚胎发育过程中有关细胞周期蛋白C合子型转录激活机制尚知甚少.本研究克隆了斑马鱼细胞周期蛋白C基因,并用Northern杂交和整体原位杂交技术检测其在胚胎发育过程中的表达状态.结果显示,斑马鱼细胞周期蛋白C高度保守,与人细胞周期蛋白C有88％的蛋白序列同源;斑马鱼细胞周期蛋白C在母型期开始表达,其表达伴随中囊胚转换时期的合子型转录激活以及整个胚胎发育过程.     

福美双引起的斑马鱼脊索波状弯曲

目的福美双是一种应用非常广泛的农药，实验研究了福美双引起斑马鱼脊索弯曲及其作用机制．方法使用福美双给受精后3小时(3hpf)的胚胎3．5cm的培养皿内染毒(5．2000nM，相当于48-480μg／L)直至24hpf.使用显微镜观察脊索等斑马鱼的外观形态学变化，以及进行原位杂交．结果在24hpf时，没有观察到各染毒组死亡率的明显提高，但在7nM(0．67微克／升）染毒组可以观察到大约半数的脊索弯曲(即有效作用浓度ED50)，斑马鱼脊索的弯曲与福美双的浓度相依存．同时观察了与斑马鱼形态学发育密切相关的SHH基因的表达，在染毒组观察到斑马鱼SHH基因表达的增加．结论试验表明福美双引起特有的斑马鱼脊索弯曲与其浓度相依存，这种弯曲与SHH基因相关联，同时试验也进一步说明斑马鱼作为农药评价模型有一定的探讨性．     

三丁基锡抑制雌性斑马鱼卵子发生

【目的】研究三丁基锡(Tributyltin,TBT)长期暴露对雌性斑马鱼(Daniorerio)卵子发生的影响。【方法】用100,500ng·L-1的TBT连续暴露斑马鱼雌性成鱼28d,设置无 TBT 暴露的对照组,并用组织学的方法检测了 TBT 对斑马鱼卵子发育和卵子发生的影响;同时采用定量 RT-PCR 方法研究了 TBT 影响斑马鱼卵子发生的分子机制。【结果】与对照组的情况相比:1)TBT 降低了斑马鱼卵巢质量和性腺成熟系数(GSI),导致早期卵母细胞增多、完全生长期卵母细胞减少和卵母细胞凋亡;2)TBT 上调了20β-hsd,cyp17a2,fshr 和lhr 基因的表达量;下调了孕激素膜受体合成相关基因 mprα 和雌激素合成主要基因cyp19a1a 的表达量。【结论】TBT 可能通过抑制雌激素合成分泌,造成卵子发育受阻;并可能通过抑制孕激素膜受体合成和降低孕激素效应,导致排卵受阻和成熟卵母细胞凋亡。
     

EE2抑制斑马鱼卵巢发育和卵母细胞发生

以斑马鱼(Danio rerio)雌性成鱼为研究对象,用不同剂量(0.1,1和10μg·L-1)的乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradiol,EE2)对其进行暴露处理20d,并采用组织学方法对卵巢发育进行观察。组织学结果表明,不同剂量的EE2对斑马鱼卵巢发育均产生严重影响:卵巢和卵母细胞发育停止,减数分裂抑制,并出现卵黄积累期生殖细胞退化现象。为探讨上述影响可能的机制,采用半定量RT-PCR的方法检测了与斑马鱼卵子发育紧密相关基因vasa、scp3和igf3在EE2处理后的表达变化。研究结果表明,EE2处理之后,vasa基因的表达没有显著变化,而基因scp3、igf3的表达明显下调,且呈时间依赖性和剂量依赖性效应。因此研究推测EE2可能通过抑制igf3基因的表达和减数分裂抑制了斑马鱼卵子的发育和成熟。