马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因5′上游调控区的分离和序列分析

利用单一特异引物聚合酶链反应技术，将马铃薯ＤＮＡ中天冬氨酸蛋白酶抑制剂家族一成员的５′上游区分离，并克隆进ｐＵＣ１８质粒ＳｍａＩ位点中．用３２Ｐ中标记的单一特异引物──ＰｒｉｍｅｒＡ为探针，经斑点杂交得一阳性克隆．ＤＮＡ测序获得含有马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因５′上游区的插入物的核苷酸序列．从这序列结构中见到ＴＡ富含区，并发现典型的调控序列ＴＡＴＡ和ＣＡＡＴ．此上游序列与国外所得到的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的上游区相比较在序列和ＴＡＴＡ及ＣＡＡＴ盒的位置上有着很大的不同．     

马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆和结构分析

以马铃薯基因组ＤＮＡ为模板并基于天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的ｃＤＮＡ序列所设计的两个引物，通过ＰＣＲ扩增得到６６６ｂｐ的天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区，并将此片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点．序列分析结果表明该基因除去末端一终止密码子外其可译框架编码２２１个氨基酸残基，前导肽包括３２个氨基酸残基，故该抑制剂的成熟蛋白由１８９个氨基酸组成，第６７位的精氨酸为抑制胰蛋白酶的活性中心．与ｃＤＮＡ相比核苷酸的同源性为９４．３％，氨基酸的同源性为９０％．基因ＤＮＡ无内含子．     

马铃薯卷叶病毒中国分离株外壳蛋白基因及其上游先导序列的cDNA克隆和序列分析

按照马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）核苷酸序列，针对ＣＰ基因及其上游基因间隔区全长约０．８ｋｂ的区段设计合成两个特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ＣＤＮＡ第一条链，再经ＰＣＲ扩增合成ｃＤＮＡ，将ＣＤＮＡ克隆于ｐＵＣ１９质粒．限制性酶切分析和核苷酸序列测定表明克隆的ＰＬＲＶ－Ｃｈ外壳蛋白（ＣＰ）基因及其上游基因间隔区的全长ＣＤＮＡ共８２４个核苷酸，与国外报道的４个ＰＬＲＶ分离株的核苷梳序列相比具有高度同源性．ＰＬＲＶ的外壳蛋白基因序列与其上游基因间隔区相比保守性更强．     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

人骨髓单核细胞表面分化抗原CD14基因的扩增、克隆和鉴定

根据人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４（ｈＣＤ１４）基因的核苷酸序列，设计ｈＣＤ１４基因５＇端和３＇端的两个引物．以人血中提取的基因组总ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术特异性扩增该基因１２４５加的编码序列．扩增产物经Ｘｂａｌ、ＫｐｎⅠ双酶切后，克隆到ｐＵＣ１８质粒ＸｂａＩ－ＫｐｎＩ位点间，随后转化大肠杆菌ＪＭ１０９．用ＰＣＲ方法筛选出重组菌落．经酶切和序列分析方法检测后，证明获得了含ｈＣＤ１４基因的重组克隆ｐＨＣＤ１４．巳测出的插入片段５＇端部分中包含着人ＣＤ１４基因４８８ｂｐ的序列，与巳报道的相应ＤＮＡ序列相比具有９９％的同源性．     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

TNF－α诱导的蛋白质因子与淋巴毒素基因5’端上游区特异性结合的研究

淋巴毒素（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，凝胶迟滞电泳分析发现，ＴＮＦ－α诱导３０ｍｉｎ的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物与ＬＴ基因５＇上游片段可形成多种ＤＮＡ－蛋白质复合物．ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验发现，ＬＴ基因５＇端上游－１０６～－８３ｂＰ（共２４ｂＰ）序列具有蛋口保护足迹：此２４ｂｐ的序列中存在一个ｋＢ样结合位点：－１００～－９０ｂＰ（５＇－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３＇）．以此蛋白保护足迹区序列而设计合成的寡核苷酸探针进行的凝胶迟滞电泳分析及竞争反应表明，ＮＦ－ｋＢ类蛋白因子参与了此序列的ＤＮＡ－蛋白质的特异性结合，提示ＴＮＦ－α可能通过激活ＮＦ－ｋＢ类蛋白质因子参与ＬＴ基因的表达调控．     

TNF—α诱导的蛋白质因子与淋巴毒素基因5‘端上游区特异性…

淋巴毒素（ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，凝胶迟滞电泳分析发现，ＴＮＦ－α诱导３０ｍｉｎ的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物下ＬＴ基因５＇上游片段可形成多种ＤＮＡ－蛋白质复合物。ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验发现，ＬＴ基因５＇端上游－１０６￣－８３ｂｐ（共２４ｂｐ）序列具有蛋白保护足迹；此２４ｂｐ的序列中存在一个ｋＢ样结合位点：－１００￣－９０ｂｐ（５＇－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３＇）。以此蛋白保护足迹     

检测丽蚜小蜂取食寄主银叶粉虱的多重聚合酶链式反应

结合Ｄ２引物和ＢＥＦ引物,优化了一个可以用来检测丽蚜小峰（Ｅｎｃａｒｓｉａ ｆｏｒｍｏｓａ Ｇａｈａｎ）取食寄主银叶粉虱（Ｂｅｍｉｓｉａ ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉｉ Ｂｅｌｌｏｗｓ＆Ｐｅｒｒｉｎｇ）的重多聚合酶链式反应。特异于银叶粉虱的ＢＥＦ引物（正向５′－ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＴＡ ＣＧＴ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＴ－３′和反向５′－ＴＡＡ ＣＣＧ ＡＡＣ ＣＡＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＴＴ ＡＴＴ－３     

人骨髓单核细胞表面分化抗原CD14基因的扩增,克隆和…

根据人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因的核苷酸序列，设计ｈＣＤ１４基因５＇端和和３＇端的两个引物。以人血中提取的基因组总ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链式反应技术特异性扩增该基因１４５ｂｐ的编码序列。     

黑曲霉（Aspergillus niger）三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GPD …

ｐＡＮＧＰＤ是用构巢曲霉ＧＰＤ基因片段为探针,从黑曲霉基因组文库中筛选到的一个三磷酸甘油醛脱氢酶基因阳性克隆。作者对该阳性克隆进行了亚克隆和序列测定,结果表明,基因片面总长２４４１个核苷酸,其中５’－端非编码区９８１ｎ．ｔ,编码区（从起始密码子ＡＴＧ到终止密友子ＴＡＧ０长１４４６ｎ．ｔ．３‘－端非编码区长２４ｎ．ｔ,基因启动子区含有盒和ＣＴ－盒序列,但无明显的ＣＡＡＴ盒和ＴＡＴＡ盒序列。     

控制细胞内游离［Ca~（2＋）］的螯合剂BAPTA衍生物的合成及结构与性能关系

控制细胞内游离［Ｃａ２＋］用的七种螯合剂ＢＡＰＴＡ衍生物已合成成功。其中对［Ｃａ２＋］低亲和力的５，５＇－二硝基ＢＡＰＴＡ及中等亲和力的５，５＇二溴ＢＡＰＴＡ、５—溴—５＇—甲基ＢＡＰＴＡ已分别应用于控制不同体系的［Ｃａ２＋］测定．本文详述它们的合成方法、性能及苯环上不同取代基对ＥＸ、Ｅｍ、Ｋｄ值影响的规律性。     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

与SMV抗性基因Rsa连锁的一个共显性SCAR标记

将ＲＡＰＤ标记转换为ＳＣＡＲ标记是更到更为可靠而有有标记的有效方法，应用集群分离体分析（ＢＳＡ）方法，筛选了９００个１００个碱基随机引物，得到了２个与单显性大豆花叶病毒抗性基因Ｒｓａ连锁的显性ＲＡＰＤ标记ＯＰＡＳ－０６１８００和ＯＰＷ－０５６００，将与Ｒｓａ连锁距离较近的ＯＰＷ－０５６６０克隆并测定ＤＮＡ序列，根据这个序列的两端设计了１对特异的寡聚核苷酸引物，用这对引物进行扩增，在抗感亲本间观察到     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

抗牙周病厌氧菌单链抗体基因的构建与表达

从牙周病厌氧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，通过基因工程方法－ＰＣＲ技术，调出其抗体的重链和轻链基因可变区序列，体外重组后得到单链抗体片段，克隆到了ｐＣＡＮＴＡＢ５载体上，在ＴＧ１中得到了成功表达。     

129小鼠CgA基因cDNA5‘端部分片段及CgA基因的克隆

通过ＲＴ－ＰＣＲ方法,从１２９小鼠脑组织中克隆到ＣｇＡ基因ｃＤＮＡ５‘端部分片段,序列分析结果表明：所克隆到的片段序列与文献中完全一致,以此片段为探针,从１２９小鼠基因组库中筛选获得阳性噬菌体１－１,克隆了ＣｇＡ基因,并与文献中的小鼠ＣｇＡ基因限制性内切酶图谱进行了比较分析。     

猪瘟病毒HCLV株E2核苷酸序列与结构分析

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＣＳＦＶ ＨＣＬＶ株Ｆ４８２代感染兔脾的细胞总ＲＮＡ中分段扩增出ＣＳＦＶ Ｅ２基因特异的３个部分重叠的ＤＮＡ片段,并将之分别克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经核苷酸序列测定和片段重叠完成了包含Ｅ２全长基因的１１４４ｂｐ序列的测定,其ＧＣ含量为４９．０％,核苷酸序列与国外报道的各株病毒的Ｅ２基因同源性分别不８３．５％＿９７．５％．     

人C2H2型锌指蛋白基因ZNF194全长cDNA的克隆

用一个含有锌指编码序列的人ｃＤＮＡ片段（Ｌ２￣９）作为探针杂交筛选人肝组织ｃＤＮＡ分子库，得到８个杂交阳性克隆，经测序和拼接后，将其整合为一条长１８３８ｂｐ和ｃＤＮＡ序列，该序列的２２１￣１６４２ｂｐ为一个完整的开放阅读框，编码了一个由４７３个氨基酸组成的蛋白质，１￣２２０ｂｐ为５′－ＵＴＲ，１６４３￣１８３８ｂｐ为３′－ＵＴＲ，在１８０１￣１８０６ｂｐ有一个加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ，３′端为１８