LPXTG基序蛋白lmo0159基因缺失株的构建及对单增李斯特菌环境适应能力的影响

单增李斯特菌(LM)是一种重要的食源性致病菌,能引发人和动物李氏杆菌病,其细胞壁表面LPXTG基序蛋白在LM致病过程中发挥重要作用。为了探讨LPXTG基序蛋白Lmo0159对LM环境适应能力的影响,本研究利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)及同源重组技术,运用穿梭质粒p KSV7载体,构建lmo0159基因缺失株LM90SB2-lmo0159。测定在不同温度、不同Na Cl浓度及3.5%乙醇环境下OD600,绘制生长曲线。结果显示:在4℃条件下,LM90SB2与LM90SB2-lmo0159生长无差异;在37和42℃条件下,LM90SB2-lmo0159的生长速度显著低于LM90SB2(P0.05);在含2.5%Na Cl的BHI培养基中,LM90SB2-lmo0159的生长受到明显抑制,显著低于LM90SB2(P0.05);在含4.5%Na Cl和3.5%乙醇的BHI培养基中,LM90SB2和LM90SB2-lmo0159生长均受到一定程度抑制,但在4.5%Na Cl条件下差异不显著(P0.05),在3.5%乙醇条件下,LM90SB2-lmo0159的生长低于LM90SB2,差异显著(P0.05)。本研究表明lmo0159基因对LM适应胁迫环境具有一定的影响,为进一步研究lmo0159基因的功能奠定了基础。     

InlA/InlB基因的双缺失对单增李斯特菌毒力的影响

为了探讨InlA/InlB对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力的影响,本研究利用同源重组技术在LM△InlA菌株的基础上构建LMInlA/InlB基因双缺失株。通过小白鼠肝脾脑细菌计数、LD50和溶血实验,研究LM在InlA/InlB基因缺失后毒力上的差异。结果显示:LM△InlA/△InlB基因双缺失株与LM菌株相比,双缺失株的LD50升高2个数量级;与LM△InlA、LM△InlB菌株相比,双缺失株的LD50均升高1个数量级;双缺失菌株在小白鼠肝脏、脾脏和脑组织内的载菌量均显著减少(P0.05);但没有改变其溶血特性。结果提示,InlA/InlB基因双缺失后,LM菌株的毒力能够明显减弱,但不改变其溶血特性。     

单增李斯特菌的检测方法研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是全世界普遍公认一种重要的人畜共患食源性致病菌,其广泛存在于各种乳制品、蔬菜、肉类等食品中,对人的健康安全造成了极大的威胁.因此,如何有效地检测出单增李斯特菌的存在是食源性疾病预防与控制的关键环节.介绍了单增李斯特菌的传统检测方法以及各种快速检测方法(免疫学方法、生物传感器、基于噬菌体检测方法和分子生物学方法).     

fruA基因对伤寒沙门菌侵袭力和生物膜形成的影响

为探究fruA对伤寒沙门菌生长、毒力及生物膜形成的影响,利用pBAD33制备fruA的高表达菌株(WT-pfruA)及其空载体对照菌株(WT-pBAD33).通过细菌的生长曲线测定、泳动试验、T84细胞侵袭实验以及96孔微量板结晶紫染色法分别检测fruA对伤寒沙门菌生长、毒力及生物膜形成的影响;同时应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析fruA对伤寒沙门菌毒力及生物膜相关基因的调控作用.结果显示,成功制备了伤寒沙门菌的WT-pfruA及其WT-pBAD33,发现高表达fruA后,伤寒沙门菌的生长无明显变化、运动能力增强、侵袭力上升、生物膜形成能力增加;同样地,与WT-pBAD33相比,WT-pfruA中动力、侵袭及生物膜相关基因的转录水平明显上调.综上,fruA基因可增强伤寒沙门菌的毒力及生物膜形成,并对其相关表型基因起正调控作用.     

单增李斯特氏菌快速鉴定技术的研究

目的:建立单增李斯特氏茵快速鉴定技术;方法: 选择Hly、Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增;结果: 单增李斯特氏菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特氏菌均扩增出两奈明显条带,其它食品中常见致病菌及非增李斯特氏菌均不见扩增条带.52株李斯特氏茵生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%(P＞0.5;X2=0.5).结论: 本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感性强、特异性高的单增李斯特氏茵鉴定方法.     

生物膜和生物膜形成菌的研究

细菌生物膜是一个复杂的微生物群落,生物膜巾除了水和细菌以外,还含有细菌分泌的胞外聚合物、吸附的营养物质、代谢产物及DNA等细菌裂解产物.介绍细菌生物膜的形成过程,并综述了近年来医学领域以几种成膜力强的条件致病菌为研究对象,从基因水平上证实了细菌细胞表面结构鞭毛、纤毛、胞外聚合物和群体感应信号分子等细胞因子对生物膜形成的影响.     

单增李斯特菌新疆临床分离株毒力基因的克隆和序列分析

为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株(简称LM90)毒力基因的变异情况,参考Genbank上收录的单增李斯特菌4b血清型菌株F2365(GeneBank登陆号AE017262)的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因序列,分别设计引物,对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行PCR扩增,回收基因序列,连接到PMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行序列的测定,将序列提交到NCBI上(登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果显示:LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%,可见单增李斯特菌新疆临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB,InlC、InlJ序列相对稳定。     

单增李斯特菌对小鼠滋养层细胞炎性体的激活

为探讨单增李斯特菌(Lisetria monocytogenes,LM)诱导小鼠滋养层细胞炎性体激活在其致小鼠流产中的作用,在体外用LM处理小鼠滋养层细胞,观察LM在细胞内的分布,检测培养基中白细胞介素(interleukin,IL)-1β水平和细胞裂解液中天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate ...     

天然植物提取物对鸡肉肠中单增李斯特菌及产品特性的影响

选择替代硝盐的商业化天然植物提取物T4NW S、DV和CS,以低温鸡肉肠为对象,通过微生物挑战实验(MCT)对其抑制单增李斯特菌效能进行了研究,并进一步分析了天然植物提取物对鸡肉肠产品特性的影响.结果表明:所选取的植物提取物对单增李斯特菌抑制效果尽管略低于传统的"亚硝酸钠+双乙酸盐(SD4)+异抗坏血酸钠"经典组合,但完全可替代硝盐显著的抑菌作用.本实验中0.6%T4NW S+0.5%CS组合,以及1.0%DV和0.5%CS+0.5%DV,均呈现与硝盐相同的抑菌效果,而且不同类型的抑菌剂的复合使用显现了互作效应,如1 mg/kg Nisin+0.5%DV的抑菌效果远远优于1.0%DV或2 mg/kg Nisin.进一步的产品特性分析显示,植物提取物可替代传统硝盐的发色作用,其中T10组的a*值甚至略高于添加硝盐产品.随着贮藏时间的延长各组值均有所下降,但添加了植物提取物的产品下降度更低,尤其是DV和T10+DV组显著更佳.各组别aw、p H值、质构等检测结果未呈现显著差异.     

单核细胞增多症李斯特菌InlC基因缺失株的构建与鉴定

为探讨单核细胞增生性李斯特菌(Lm)InlC基因在Lm致病性中的作用,本研究对其进行缺失。以单核细胞增多症李斯特菌4b血清型临床分离株LM-90SB2DNA为模板,扩增出用于缺失InlC基因的上、下游同源臂。运用SOE-PCR技术,将上、下游同源臂融合扩增得到△InlC基因缺失片段。将△InlC基因缺失片段与自杀性质粒p KSV-7连接,构建p KSV7-△InlC质粒。电转p KSV7-△InlC于LM-90SB2感受态细胞中,经过10μg/m L氯霉素和41℃下连续传代15代,获得单交换重组株,然后在41℃氯霉素中传至第108代,获得双交换重组株,菌液用旁侧引物进行PCR鉴定,然后30℃无氯霉素条件下连续传代培养30代丢失自杀性质粒并检测其遗传稳定性。结果显示:获得LM90SB2-△InlC缺失突变株,旁侧引物扩增只有1条1480 bp大小的片段,同时,对缺失片段进行测序验证,结果表明成功对InlC基因进行了缺失,并且缺失株遗传稳定。LM90SB2-△InlC的构建为进一步研究InlC基因在LM毒力中的作用奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的构建研究

为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组,通过PCR进行重组菌鉴定。结果表明:成功筛选得到遗传性稳定的LM ncRNA rli60基因缺失株,为揭示LM ncRNA rli60基因功能提供了研究材料;同时,为进一步研究其在LM致病性及环境应激中的分子机制奠定了基础。     

srtA基因缺失对LM环境应激及生物膜生成能力的影响

为了解srtA对单增李斯特菌(LM)环境应激及生物膜生成的影响,本实验比较了缺失株LM90SB2-△srtA与野生株LM90SB2在不同温度、pH、渗透压、H_2O_2条件下的生长情况、药物敏感性及生物膜生成能力的差异。结果表明:缺失株在致死酸(pH 3.5的盐酸和乳酸)条件下的存活率(55%和54%)低于野生株在致死酸(pH 3.5的盐酸和乳酸)条件下的存活率(71%和75%),统计学处理结果显示其差异显著;缺失株在培养12、24 h后生物膜交联程度和着色区域厚度低于野生株。但在不同温度、pH、渗透压、H_2O_2条件下的生长以及药物敏感性上均无明显差异。提示srtA分选的表面蛋白可能参与致死酸度条件下的存活和生物膜的密集度。     

调控蛋白PrfA的单个氨基酸突变对单核细胞增生李斯特菌毒力基因转录水平的影响

PrfA是单核细胞增生李斯特菌（L．monocytogenes）中迄今为止发现的唯一一个调控绝大多数毒力基因转录表达的蛋白因子．为了深入研究PrfA结构和功能的关系,模拟一株自然界分离得到的PrfA组成型突变株P14A（血清型4b）,将标准野生株EGDe（血清型1／2a）的PrfA第145位甘氨酸突变为丝氨酸（简称PrfA＊）,分别构建野生型PrfA和突变型PrfA＊表达融合载体,提取并纯化相应蛋白用于体外转录,直接检测依赖于PrfA的毒力基因plcA,hly和actA启动子的转录活性;同时,将携带pr似和PrfA＊的载体分别电转化入PrfA＊基因缺失菌株中,应用实时RT—PCR检测plcA,hly和actA体内转录水平．实验结果显示：突变型PrfA＊蛋白明显增强了plcA,hly和actA启动子的体外转录活性;依赖于PrfA的毒力基因在携带突变型PrfA＊蛋白的菌株中的体内转录水平远远高于携带野生型PrfA蛋白的菌株,说明PrfA第145位甘氨酸突变为丝氨酸后增强了PrfA蛋白与其靶基因的结合能力,从而提高其表达水平．     

等离子体活化水冰对纯培养及三文鱼片表面单增李斯特菌杀菌效果研究

研究等离子体活化水冰(PAW-ice)对纯培养以及人工接种于三文鱼片表面单增李斯特菌的杀菌效果,并通过发射光谱检测等离子体中主要活性物质,测定PAW-ice氧化还原电位、p H值和电导率,同时检测染菌三文鱼片在贮藏过程中总挥发性盐基氮(TVB-N)含量和p H值的变化.结果显示:与无菌水冰(sterile water-ice,SW-ice)相比,PAW-ice对单增李斯特菌纯培养杀菌效果显著,可以使细菌降低1～3个lg CFU/mL值,杀菌效率取决于PAW制备时间、制备体积以及PAW-ice处理时间;此外,在4℃贮藏5天过程中,与SW-ice相比,PAW-ice可以有效抑制染菌三文鱼片表面单增李斯特菌生长并减缓三文鱼片TVB-N值和p H值上升.此结果表明PAW-ice对三文鱼片表面单增李斯特菌的控制具有良好应用前景.     

环境因素对降解型生物膜形成的影响

采用改良微孔板法, 考察pH、温度、培养时间和目标污染物浓度4 个环境因子对3 株氮杂环芳烃降解菌成膜的影响。结果表明, pH、温度、培养时间对生物膜的形成影响显著, 且各降解菌的最佳成膜条件分别为: BC026成膜的最适pH为7, 最适温度为35℃, 培养时间为36 小时; BW001成膜的最适pH为8, 最适温度为35℃, 培养时间为48小时; BW004成膜的最适pH为7~9, 最适温度为40℃, 培养时间为36小时。在0~1600 mg/L的目标污染物浓度内, 目标污染物对生物膜形成的影响不显著。     

植物乳杆菌Y42无细胞培养上清抑制单增李斯特菌生物膜形成研究

为研究植物乳杆菌Y42无细胞培养上清对单核细胞增生李斯特菌(LM)生物膜形成的抑制作用,采用微孔酶标板刃天青显色法确定Y42上清的最小抑菌质量浓度(MIC),微孔酶标板结晶紫染色法检测Y42上清对LM生物膜形成的影响,软琼脂法测定Y42上清对LM爬行运动性的影响。结果显示Y42上清最小抑菌质量浓度为60mg/mL;当Y42上清作用质量浓度为MIC的1/32、1/16、 1/8、 1/4、 1/2时,LM的运动圈直径由81.15mm减小为78.31、 75.35、 69.51、 54.91、33.09mm,对LM生物膜形成的抑制率达到32.90%、 30.81%、 40.75%、 39.93% 、12.15%;普通光学显微镜在10×40倍放大倍数下,观察到Y42上清可显著减少LM在盖玻片上形成生物膜的量。Y42无细胞培养上清可通过抑制LM的运行性来抑制其生物膜的形成。     

单增李斯特菌致流产小鼠子宫中Th1和Th2细胞因子的变化

为探讨Th1和Th2细胞因子在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)致小鼠流产中的作用,用LM感染妊娠小鼠和小鼠巨噬细胞,统计胚胎存活率,酶联免疫测定(enzyme linked lmmuno sorbent assay,ELISA)小鼠子宫组织中和巨噬细胞培养基中主要的Th1和Th2细胞因子水平.结果显示,LM诱导的流产小鼠子宫中Th1细胞因子水平显著增加,溶血素O(listeriolysin O,LLO)基因缺陷型(Δ hly)LM感染组胚胎存活率和子宫中Th1、Th2细胞因子水平无显著变化;LM感染的巨噬细胞分泌的Th1细胞因子和白细胞介素-4(interleukin, IL-4)水平显著增加,IL-10水平显著降低,Δ hly LM感染组Th1和Th2细胞因子水平无显著变化.因此,LM感染后子宫中Th1/Th2细胞因子失衡诱导了小鼠流产,这可为临床防治LM诱导的流产提供科学依据.     

环境因素对溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影响

为了研究不同环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HN08155生物膜形成的影响,本研究采用改良的微孔板方法,结果显示:在3个不同培养基中,于2216E培养基中生物膜形成的速度最快,与其他实验组存在明显差异;在p H4~9范围内,当p H值为7.0时,溶藻弧菌形成的生物膜量最高;质量浓度为0.5%的Na Cl最适宜溶藻弧菌生物膜的生成,但Na NO3不能促进生物膜的形成;低浓度Ca Cl2可促进生物膜形成,Mg Cl2不参与溶藻弧菌生物膜的生成.由此得出结论:溶藻弧菌生物膜的形成依赖于环境条件,不同环境因子对溶藻弧菌生物膜的形成有不同的影响.     

宁夏食源性单增李斯特菌毒力基因的分布研究

了解宁夏地区食源性单增李斯特菌(LM)的毒力基因分布特点.用PCR方法对85株LM进行16种毒力基因检测.结果表明,85株菌中有55株含有全部的16个毒力基因,actA基因的缺失率为22.35%,inlB和iap基因的缺失率均为10.59%,inlC基因的缺失率为9.41%,prfA和plcA基因的缺失率均为4.71%,mpl和virR基因的缺失率为分别为2.35%和1.18%.宁夏地区LM的毒力基因缺失不严重,部分食品潜在危险较大,一些毒力基因的缺失存在多样性.     

黄芩提取物对脓肿分枝杆菌生长及生物膜形成的影响

为了研究黄芩提取物对脓肿分枝杆菌浮游细菌及生物膜的影响,本研究以脓肿分枝杆菌标准菌株ATCC 19977以及临床分离株作为受试菌,采用Alarmar-Blue液体药敏法测定黄芩提取物对脓肿分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC）,平板涂布法测定最小杀菌浓度（MBC）,结晶紫染色法和扫描电子显微镜分析黄芩提取物对脓肿分枝杆菌生物膜形成量及形态结构的影响,进一步采用了RT-qPCR探究黄芩提取物对分枝菌酸合成相关基因表达的影响.结果表明黄芩提取物对脓肿分枝杆菌标准菌株ATCC 19977以及8株临床分离株的MIC90为50~100 mg/mL,MBC为50~200 mg/mL;黄芩提取物可显著降低脓肿分枝杆菌生物膜形成量（P<0.05）,破坏生物膜的结构,并且显著降低分枝菌酸合成相关基因表达量（P<0.01）.本研究表明黄芩提取物能够抑制脓肿分枝杆菌的生长以及生物膜的形成.