Sericin 1上游调控序列多态性分析

在克隆家蚕sericin 1基因上游调控序列时，出现多种扩增情况．为了调查其多态性，对野桑蚕、家蚕70个品系基因组进行了PCR扩增，扩增出660bp（DQ354392）、1000bp及660bp和1000bp同时出现的3种类型,序列分析表明：1000bp的条带与NCBI中登录的sericin 1（AB00783）上游调控序列一样；多态性存在于顺式作用元件之前，而顺式作用元件区域是非常保守的．     

百脉根Rac1基因启动子的克隆与表达分析

百脉根小G蛋白Rac1基因促进共生结瘤过程,但其转录调控机制尚不明确.采用生物信息学方法对百脉根Rac1基因的启动子序列进行了预测,并对该启动子中含有的顺式调控元件进行了统计分析.克隆了约1.8kb的启动子片段,并构建了GUS融合的重组质粒p1391Z-Rac1Pro.通过百脉根毛根转化法获得转基因毛根,进一步利用组织化学染色法对Rac1基因在阳性毛根中的表达部位进行了研究.结果显示:该启动子除含有常见的转录调控保守元件TATA-box和CAAT-box外,还含有调控防御和胁迫、激素、光照等信号的应答元件.组织化学染色发现,Rac1基因在接种根瘤菌的根毛、根尖、根瘤原基皮层中表达量较高.     

中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析

为了探明中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子表达调控机制,利用DNA步移法克隆了中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子及其上游调控序列,总长1 100bp.分析表明,在基因转录起始位点上游-30～-24bp处有1个TATA box,未发现有CAAT box和GC box.同时,在上游调控区还存在有多个可能影响启动子转录活性的顺式作用元件,如NF-κB,YY1和SP1等转录因子结合位点.这些结果为深入研究中国明对虾卵黄蛋白积累及卵子发生过程奠定了基础.     

PCR法克隆卤虫（Artemia franciscana） Artemin基因上游调控序列

利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大为750bp的片段，将这一上游序列片段克隆到pMDl8-T载体中，以获得包括启动子、增强子等顺式作用元件在内的Artemin基因的上游调控序列，为进一步研究Artemin基因的表达模式及其功能提供依据。     

白菜防御素基因的预测及结构功能分析

采用生物信息学的方法,通过已知防御素基因家族基因氨基酸序列在线Blast相似性比对,对白菜(Brassicarapa)基因组中防御素基因进行了预测和鉴定,分析了防御素基因在进化过程中各部分结构,包括上游区域、启动子区域、外显子区域、内含子区域以及UTR区域的结构变异以及功能变异,对该基因上游序列顺式作用元件和表达模式进行了预测。分析结果表明,白菜防御素基因编码60～80个氨基酸短肽,编码氨基酸均具有8个保守的半胱氨酸;白菜防御素基因功能结构域保持相对稳定,但部分基因成员前端信号肽序列出现变异;内含子长度出现增长、缩短、消失等3种变异模式;该基因上游启动子区域核苷酸变异较其他区域显著,上游序列顺式作用元件大多与光应答、逆境胁迫应答和信号分子应答相关。该基因表达模式预测结果表明白菜防御素基因在进化过程中可能出现分化,主要体现在基因沉默和表达部位的差异。     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

中国梨S RNase基因启动子的TAIL PCR 克隆及功能预测

利用TAIL PCR技术从中国砂梨品种‘金花’、‘懋功’及白梨品种‘鸭梨’基因组DNA中分 别扩增出长度为854、1 448和1 137 bp的S13-、S12-、S21-RNase基因5′端上游序列,并提交 GenBank,序列号为HM047239、HM047240、HM047241。经PLACE和PlantCARE软件顺式调控元件预测发 现,这3个启动子均具有典型核心启动子TATA 盒和 CAAT 盒,且在上游均存在光应答调控元件(box 4,G box)、脱落酸应答元件ABRE及水杨酸应答元件TCA element等,由此可知其可能受光照、脱 落酸、水杨酸等多种条件的共同调节。此外,与已知日本梨S2-、S3-、S4-、S5-RNase基因启动子序 列比对发现,S RNase启动子TATA盒上游存在一约200 bp的同源区域。以MEG 4.0构建系统发育树表 明,梨属和苹果属S RNase等位基因多态性可能在亚科的分化之前就已形成。     

猪血清白蛋白基因5'端调控区的克隆与分析

根据已报道的hsa(人血清白蛋白基因)启动子序列设计了一对引物,以猪的基因组DNA为模板,采用PCR扩增出一条256 bp DNA片段,用Primer Premier5.0和Promoter Scan Ⅱ软件进行分析.结果表明,此序列为psa基因5'-端上游包括启动子在内的调控区,该区域含有一般启动子典型的CAAT-box、TATA-box等基本顺式作用元件.另外,还含有CTF/NF-1、CTF、APF、HNF-1、CP1等转录因子的结合位点.     

文昌鱼Pax1/9基因上游调控区的克隆及分析

脊椎动物Pax1/9是一重要的发育调控基因亚家族,文昌鱼基因组中仅有单一的该亚家族直系同源基因Amphi-Pax1/9,为检验此基因上游调控元件的功能在脊椎动物体内是否具有通用性,将文昌鱼Pax1/9基因上游约4.6 kb的侧翼序列与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因连接,构建重组质粒表达载体(pAmphiPax1/9-AcGFP),显微注射斑马鱼胚胎,并以斑马鱼Pax1和Pax9的上游同源序列为阳性对照.结果表明,阳性对照斑马鱼胚胎中GFP能够表达,但注射pAm-phiPax1/9-AcGFP质粒的斑马鱼胚胎中无明显的GFP表达,这一现象可能是由于Pax1/9上游调控序列在二物种间存在较大的进化差异,启动元件具有物种特异性.     

厚叶旋蒴苣苔BcWRKY2基因5''端调控区的克隆及功能元件分析

在克隆厚叶悬蒴苣苔干旱诱导表达转录因子BcWRKY2基因的基础上,利用接头介导的PCR(LM-PCR)技术,从基因组DNA中克隆了908bp的BcWRKY2基因的上游调控区序列.序列分析显示,该启动子中存在多种非生物胁迫反应元件,如ABA反应元件ABRE、干旱反应元件DRE/C-repeat以及MYB结合位点MBS(MYB binding site involvedin drought-inducibility)等.     

大豆降解组文库microRNAs的启动子分析

研究目的：创新要点：通过分析miRNA的核心启动子和顺式作用元件为进一步解析大豆（Glycinemax）miRNAs表达调控及其功能研究提供重要信息。利用生物信息学方法全面解析了大豆降解组文库miRNA的启动子特征,并依据顺式作用元件及靶基因构建了miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之问存在潜在的负反馈调控网络。研究方法：本研究利用TSSP程序和PlantCARE数据库预测了来自大豆降解组文库的440个miRNA的核心启动子以及369个miRNAs的顺式作用元件,并依据顺式作用元件及靶基因构建miRNA调控网络。重要结论：83．86％的miRNA在其上游序列中含有启动子,8．64％的miRNA在其下游序列中含有启动子,21．59％的miRNA包含增强子。核心启动子的TATA盒与转录起始位点（TSSs）的分布相似（见图2）。此外,对转录起始位点5’端的顺式作用元件预测为miRNAs的可能功能和表达的时空性提供了线索。miRNAs的顺式作用元件和靶基因的分析显示,部分miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之间存在潜在的负反馈调控（见图3）。     

厚叶旋蒴苣苔BcWRKY2基因5′端调控区的克隆及功能元件分析

在克隆厚叶悬蒴苣苔干旱诱导表达转录因子BcWRKY2基因的基础上,利用接头介导的PCR(LM-PCR)技术,从基因组DNA中克隆了908bp的BcWRKY2基因的上游调控区序列。序列分析显示,该启动子中存在多种非生物胁迫反应元件,如ABA反应元件ABRE、干旱反应元件DRE/C-repeat以及MYB结合位点MBS(MYB binding site involved in drought-inducibility)等。     

绿僵菌NTL基因上游调控序列的克隆及分析

实验室已经克隆了金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因（NTL）的编码序列（GenBank登录号：AY557612）,为了解该基因的上游调控信息,采用Panhandle Polymerase Chain Reaction Amplification方法获得了长为982bp的中性海藻糖酶基因上游序列.序列分析表明,该序列含有5个CAAT启动子元件和一个压力反应元件（CCCCT）.经PCR和Southern杂交验证表明,利用panhandle PCR法成功地获得了金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因上游序列,并且该基因在金龟子绿僵菌基因组中以单拷贝形式存在.     

人NLK上游启动子区的克隆与鉴定

初步鉴定并分析NLK上游启动子,为研究其转录调控打下基础。对NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的序列分别进行生物信息学分析,以PCR技术扩增以上序列并测序。将PCR所得到的NLK上游片段进一步克隆到PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒PGL-3basic-luc。通过荧光素酶报告基因实验检测上述启动子的活性。成功构建了包含NLK基因上游启动子序列的荧光报告系统,经荧光素酶报告基因实验证明该重组质粒体具有转录活性。构建的NLK基因上游启动子报告基因载体为进一步研究NLK基因的转录调控机制奠定了基础。     

6个大豆GmBES1基因干旱诱导表达及启动子分析

BES1/BZR1转录因子在油菜素内酯信号通路中发挥重要作用，该通路调控植物的生长发育及对各种胁迫的抗性。本研究对6个大豆GmBES1基因在干旱胁迫下的表达量进行检测，同时对6个Gm BES1基因启动子中的顺式作用元件进行预测分析。实时荧光定量PCR结果显示，6个GmBES1基因在干旱胁迫下的表达量随着时间存在不同程度的变化，其中GmBES1-9的表达量升高最明显。启动子序列预测分析结果显示，GmBES1-2/3/6/9/11/12启动子序列中分别含有3、6、4、3、4和7种激素及逆境响应相关顺式作用元件。这些结果为大豆GmBES1基因的抗旱机制研究及应用提供理论依据。     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

水稻Rho家族OsRac2启动子的转基因功能鉴定

采用PCR扩增的方法,构建了OsRac2基因转录起始位点上游1.7 kb的启动子5′缺失植物表达载体,转化烟草并筛选阳性转基因植株.以多种激素处理转基因烟草,通过组织化学分析和GUS荧光活性的检测,证实Os-Rac2启动子上存在着一些激素应答元件,该基因的表达可能受茉莉酸的正调控,脱落酸等激素的负调控.     

番茄红素β-环化酶基因（LcyB）启动子调控LcyB RNAi双元载体构建

根据番茄基因组DNA序列信息设计引物进行PCR扩增了Micro-Tom中番茄红素-环化酶（Lycopene -cyclase, LcyB）基因起始密码子上游1 534 bp启动子区域序列（LcyBp）,生物信息学分析表明,该启动子序列中存在TATA-盒、CAAT-盒、昼夜节律响应元件Circadian、光响应元件Box I、真菌激发子响应元件Box-W1、低温响应元件LTR、响应赤霉素的作用元件P-box、乙烯响应元件ERE、响应生长素的作用元件TGA-element等顺式作用元件. 依据番茄LcyB基因序列,设计2对含有不同酶切位点的特异引物进行PCR扩增LcyB基因3端特异的276 bp DNA片段,利用RNAi载体pKANNIBAL构建了LcyB启动子-LcyB基因正义片段（Sense）-PDK内含子-LcyB基因反义片段（Antisense）-OCS终止子的RNAi表达框,并将这一RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的Not I位点,构建成本研究的LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB. 为利用RNAi技术特异性敲除LcyB基因进而提高番茄果实中番茄红素含量奠定实验基础.     

AcMNPV polh启动子上游增强序列的部分缺失分析

本实验构建了2个用于杆状病毒AcMNPV(苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒)启动子及其调控序列研究的质粒载体:pF SBCAT和pF SBCATPpolh.以此为基础,结合目前对BmNPV(家蚕核多角体病毒)polh(多角体)基因和AcMNPVpolh基因上游增强序列的研究结果,构建了AcMNPVpolh基因上游增强序列部分缺失的瞬时表达载体;以cat为报告基因,利用瞬时转染和CATELISA的方法检测报告基因的表达活性,初步研究了对于polh启动子具有增强作用的AcMNPVpolh基因上游序列的结构.结果显示,与BmNPVpolh上游293bp序列同源性极高的AcMNPVpolh上游293bp片段对于polh启动子没有增强活性;CMVm启动子的AcMNPVpolh上游增强序列部分缺失之后不能够增强AcMNPVpolh启动子.因此,这一序列可能不再被缩短,也不大可能存在独立地起作用和更短的正、负调控元件.     

白桦BpTCP7基因启动子的克隆及表达分析

【目的】研究BpTCP7启动子的表达模式,为深入分析BpTCP7基因功能提供一定参考。【方法】克隆了BpTCP7基因上游1 791 bp启动子序列,通过PLACE和Plant CARE网址对顺式作用元件进行分析,然后转入拟南芥,并分析BpTCP7启动子的组织表达特性及盐、旱胁迫应答反应。【结果】BpTCP7启动子序列中含有与细胞周期、开花、叶片发育、激素及胁迫响应等相关的顺式作用元件。该启动子在拟南芥中的表达模式呈现为营养生长阶段和生殖生长阶段均有表达,且在叶片中表达明显,与此同时,BpTCP7启动子在幼嫩、成熟叶片的边缘均有表达。与对照相比,NaCl、PEG胁迫诱导处理后BpTCP7基因表达量有升高的现象。【结论】BpTCP7基因参与白桦的叶片发育、激素应答、胁迫响应(盐、干旱)等生物学过程,对营养、生殖生长阶段各组织器官的发育也有一定的调控作用。