DPA-Zn金属阳离子脂质的合成及转染活性研究

基于Zn(II)-二甲基吡啶胺(Zn-DPA)合成了含十六烷基醇疏水性尾部的单/双核金属阳离子脂质6a-6b.通过凝胶电泳、溴乙锭置换和粒径电位实验考察了它们与质粒DNA的相互作用.结果表明,两个金属脂质均可将DNA包裹缩合成具有适当粒径大小和zeta电位的纳米颗粒.并且,双核金属脂质6b具有比单核脂质6a更强的DNA结合能力.MTT细胞毒性实验显示金属脂质体/DNA复合物具有较低细胞毒性(细胞存活率大于80%).体外基因转染研究表明,单核金属脂质6a的转染效率优于双核金属脂质6b.     

脂质体--基因载体

概述了基因载体的作用、类型和脂质体用于基因载体的发展历史,介绍了一类很有前途的基因载体．阳离子脂质体的组成结构和分类及其转基因的作用原理,讨论了影响阳离子脂质体／DNA复合物物理化学性质的参数及其目标复合物的制备方法．     

阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究

利用阳离子脂质体作为载体,用其搭载鱼精蛋白与STAT3 siRNA复合物,通过一系列实验证实该复合体系可显著抑制STAT3基因在黑色素瘤细胞B16中的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。首先对载体材料进行了一系列表征测定,检测了不同复合比例下载体和siRNA复合物的粒径和电位。利用载体和siRNA的复合物对B16细胞进行转染并测定转染效率,随后对复合材料的毒性进行了检测。此外还进行了细胞凋亡、平板克隆、荧光定量PCR以及Western Blot等一系列实验来进一步确定载体复合物的有效性。实验结果表明,阳离子脂质体搭载复合了鱼精蛋白的STAT3siRNA表现出了良好的靶向治疗性及优秀的递送效率,且复合体系稳定性良好,毒性低。     

阳离子脂质体基因载体的稳定性研究

从阳离子脂质体的形态、平均粒径、粒径分布、Zeta电位及浊度等方面,考察了季铵盐型阳离子脂质体CPA14的稳定性。经透射电子显微镜检测,阳离子脂质体呈球形结构,粒径为100~200 nm。经粒度分析仪检测,阳离子脂质体平均粒径为210~260 nm,颗粒分布均匀,Zeta电位为55~90 mV。脂质体在4 ℃条件下存放3个月,外观无明显变化,脂质体的浊度变化不大。证实季铵盐型阳离子脂质体CPA14稳定性良好,适合用作基因载体进行基因转运。阳离子脂质体与质粒DNA在N:P质量比为3:1时可高效转染人宫颈癌细胞,与商品转染试剂DOTAP转染效率相当。为新型季铵盐型阳离子脂质体基因载体的构建提供了理论依据。     

阳离子脂质体在基因治疗中的应用

介绍了阳离子脂质体的组成和结构特点以及作为基因载体在基因治疗方面的应用．阳离子脂质体转基因的机理研究表明：阳离子脂质体／基因复合物进入细胞的方式依赖于细胞的内吞作用或通过细胞的膜融合作用．     

一种新颖的阳离子非病毒基因载体 Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH 的性能研究

研究了新型阳离子聚合物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的性能，重点考察其粒度，基因转染效率与细胞毒性，探讨了其作为基因载体的可能性.通过动态光散射仪（DSL）、透射电镜（TEM）观察了Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH与DNA自组装形成的颗粒形态及粒径，Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH可复合DNA形成粒径160～210 nm的纳米复合物，适合进入细胞.使用MTT比色法分析Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的毒性并与PEI，PEI-g-PEG-OH比较.选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 转染Hela细胞，应用流式细胞术检测转染效率.新型阳离子多聚物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性，有望成为基因转移的有效载体.     

基因转运载体的原子力显微镜研究

通过原子力显微镜观测阳离子脂质体及其与DNA复合物的结构。将一定量的阳离子脂质体以及阳离子脂质体／DAN复合物滴加到新解理的云母片上,干燥后用原子力显微镜观测。结果表明,阳离子脂质体在云母片上形成的颗粒为球形或椭圆形,粒径分布较为均匀;阳离子脂质体／DNA复合物在云母片上的颗粒形状不规则,粒径分布不均且比空白脂质体的粒径大。通过原子力显微镜可以快速有效地观测脂质体以及脂质体／DNA复合物的粒径、表面形态等,为分析脂质体的物理化学性质与基因转运效率的关系提供了一种研究方法。     

基于低分子量PEI的不同疏水链修饰的梳状低聚物基因载体

为了探究基于低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)基因载体的转染效率,通过Michael加成反应将PEI 600 Da接枝于含有疏水链的生物可降解聚酯上形成系列梳状聚合物,并将之应用于基因载体;利用核磁氢谱和凝胶渗透色谱对聚合物的化学结构与分子量进行了测定,此外,还利用凝胶电泳实验和绿色荧光蛋白实验研究了聚合物与DNA的结合能力及其复合物的转染性能。结果表明：本文方法成功合成了系列低聚物,并对DNA表现出较好的包裹能力;油酸修饰后的低聚物与DNA复合物在质量比为6.4时转染效果与PEI 25 kDa相当。可见,油酸修饰后的脂质体低聚物有作为非病毒基因载体的前景。     

基于生育酚修饰的低分子量聚乙烯亚胺基因载体

制备了基于生育酚交联的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)可降解脂质体聚合物基因载体。凝胶阻滞实验结果表明它能很好地包裹质粒DNA,使其免受核酸酶的降解。通过在体外He La细胞和HEK 293细胞中的绿色荧光蛋白转染实验结果表明,这种生育酚修饰的聚合物材料在无血清存在下表现出比"黄金标准"PEI高的转染效率。因此,推测这种材料具备了作为非病毒基因载体的潜在性。     

PLA-PAMAM纳米粒作为非病毒基因载体的研究

采用乳化-分散-蒸发方法制备了表面含有聚酰胺-胺树状大分子的聚乳酸纳米粒,并将DNA与该阳离子纳米粒复合,研究了复合物的理化性质、细胞毒性和转染效率.结果表明在氮/磷比为2以上时,DNA与阳离子纳米粒形成了稳定且带正电的复合物,能保护DNA抵御核酸酶的降解,且复合物的细胞毒性较小.在无血清介质中,阳离子纳米粒可以将DNA有效地转移到细胞内得到表达,转染效率与未纳米化的PAMAM相比有明显的提高,且转染的最佳氮/磷比为2～5.     

复合环境离子强度对BDCP/DNA的粒径与转染效率的影响

为了探讨组装环境对基因载体/DN复合物的粒径和转染效果的影响,在三种不同离子浓度溶液体系(PBS, 5% 葡萄糖溶液, H₂O)中测量BDCP（biodegradable cationic polymer,一种生物可降解的阳离子聚合物）/DNA复合物粒径和结合力,进行了体外转染试验和毒性试验.结果显示,PBS最适合组装转染复合物,可取得更好的稳定性、最高的转染效率和较低细胞毒性、低溶血率;在5%葡萄糖溶液和水中组装的BDCP/质粒复合物结合力较弱,转染效率比较低.得出结论,BDCP/DNA粒径、结合力和基因转染效率受组装体系的离子强度影响.     

以芳香亚胺为连接剂的聚乙烯亚胺衍生物的合成及体外活性研究

通过有机合成的方法合成新型聚阳离子载体聚五乙烯六胺对苯二甲醛-1,4-二亚胺(PEHA-TPAI),产物结构经核磁共振氢谱(1H NMR)和傅里叶红外光谱(FT-IR)确定系目标产物。采用琼脂糖凝胶电泳实验观察PEHATPAI包裹小干扰RNA(siRNA)的能力,并用粒度仪和Zeta电位仪对PEHA-TPAI/siRNA复合物进行表征。结果表明:PEHA-TPAI和siRNA复合后可形成稳定且粒径均一的纳米颗粒,在PEHA-TPAI/siRNA复合物质量比为10∶1的条件下,颗粒粒径为(129.90±1.02)nm,Zeta电位为(21.1±0.54)mV。体外细胞毒性实验和转染实验的结果表明:PEHA-TPAI的细胞毒性显著低于商业化转染试剂聚乙烯亚胺(PEI,分子量为25 000)(P0.001)且具有良好的转染效率,有作为低毒性、高转染效率的基因输送载体的潜力。     

组氨酸修饰的聚乙二醇-聚谷氨酸-聚乙烯亚胺作为基因载体的体外性能研究

为了对组氨酸修饰的阳离子聚合物载体进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。采用自由基聚合法合成聚乙二醇-聚谷氨酸-聚乙烯亚胺-组氨酸(PEG-b-PLG-g-PEIsHISs,GGIS)聚阳离子载体,用1H-NMR表征载体材料结构;通过凝胶电泳实验研究载体对质粒DNA的压缩能力,粒径分析仪测定载体结合DNA后在不同N/P比条件下的粒径及表面电荷;用MTT法测定载体在HEK293T,Hela,BEL7402和A549等细胞株上的细胞毒性,考察GGIS体外细胞转染效率。结果显示在N/P≤30时,载体材料的平均粒径在100~200 nm,表面电荷在10~30 m V,适合细胞吞噬。体外细胞毒性表明,GGIS的细胞毒性较PEI 25K低。GGIS具有较强的DNA缩合能力,且有较好的体外基因转染能力。因此,GGIS有较好的体外基因转染能力,能够携带报告基因在体外有效表达,是具有应用前景的非病毒性基因药物载体。     

基于合成非病毒基因载体的教学实验开发

基因载体构建是生物制药技术课程中的重要内容,也是生物医药领域的前沿技术。常见的基因载体包括病毒载体和非病毒载体。非病毒载体能够有效地包载基因,操作安全简便,但是其转染效率远远不及病毒载体。通过改变非病毒基因载体的结构、尺寸、表面电荷等性质,人们能够有效地提高其转染效率。基于此,本实验设计了常用基因载体支化聚乙烯亚胺(bPEI)与DNA在不同电荷比的复合实验,并对复合物粒子的粒径和电势变化进行表征。该实验不仅可以让学生掌握粒径仪的工作原理和使用方法,通过对实验条件的摸索,还能够加深学生对非病毒基因载体的认识。     

新型纳米复合材料作为非病毒基因载体的研究

为了制备理想的非病毒基因载体,合成了甲壳三糖-g-壳聚糖(TCS),并与钙基累托石(REC)插层复合制备纳米复合材料,采用X射线衍射和透射电镜方法对产物进行了表征,考察了其细胞相容性,将REC、TCS和纳米复合材料分别与质粒DNA复合形成复合物,并考察了其体外基因转染效果.结果表明:TCS、REC及纳米复合材料的细胞相容性良好,当N/P比为3时,TCS/DNA复合物粒径大小都在75 nm左右,REC加入后,其粒径不同程度地增大,最大达到191 nm;相对分子质量高的TCS所得DNA复合物较相对分子质量低的TCS所得DNA复合物稳定,而REC的加入降低了TCS/DNA复合物的稳定性;TCS/REC-DNA复合物能介入肝癌细胞中并表达荧光.说明该纳米复合材料可作为潜在的非病毒基因载体.     

肿瘤基因治疗载体的研究进展

对在肿瘤基因治疗中较常见的载体--病毒载体(痘苗病毒载体、腺病毒与腺病毒相关载体、单纯疱疹病毒和逆转录病毒)和非病毒载体(脂质体和稳定质粒--脂质颗粒)进行了介绍,同时对其存在的问题作了简要阐述,并对该研究前景进行了展望.     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

糖杯芳烃基因载体GGC[4]的合成及性能研究

设计并制备了一种新的具有分子探针功能的主体分子型非病毒载体双子糖杯芳烃主体分子(GGC[4]),应用透射电子显微镜(TEM)观测到主体分子GGC[4]与DNA分子相互作用形成超分子纳米复合物的微观结构形态.体外细胞转染实验表明其具有较高的转染效率.本研究为设计制备新的非病毒基因载体提供了一种新途径.     

磷酸化壳聚糖-季铵化壳聚糖载体提高体内外基因转染功效

本研究通过磷酸化壳聚糖(PC)包被季铵化壳聚糖(TMC)/质粒(pDNA)纳米复合物,制备PC/TMC/pDNA三元复合物(PTC),用于提高体内外基因转染功效.PTC粒径为100~200nm,Zeta电势为-16~-34mV,可有效缩合pDNA,保护pDNA免遭核酶降解.PC降低PTC中pDNA结合力,增加体外释放量.表面荷负电的PTC抗非特异性蛋白吸附能力强,经小窝蛋白介导的细胞内吞途径入胞后逃避溶酶体降解,细胞核内分布比例高.HEK293细胞体外转染试验结果显示,PTC体外转染效率是TMC/pDNA纳米复合物(TC)的1.5~3.1倍;小鼠胫前肌注射给药试验结果表明,PTC可显著提高基因体内转染效率.因此,合适质量比的PTC有望作为功能性基因药物的递送载体,用于基因治疗.