植酸酶基因表达与调控机制研究（Ⅱ）：番茄幼苗 …

采用异氰酸胍法从发芽３－４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ。     

条斑紫菜丝状孢子体cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定

经过微量总RNA抽提、cDNA合成、cDNA扩增和克隆等步骤，构建了微量条斑紫菜丝状孢子体cDNA库，并进行了小规模表达序列标签分析。从170条标签序列中鉴定出6条抗病相关基因序列。这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记，辅助紫菜抗性遗传改良。     

全长cDNA文库构建方法及应用研究

构建全长cDNA文库是获得大量基因全序列信息的有效途径,也是进行功能基因组研究的一条经济、快速的途径,它克服了常规cDNA文库的缺点,极大地推进了功能基因组的研究,尤其是对于那些因基因组庞大而未能进行全基因组序列测定的生物来说更为重要．全长cDNA文库的研究在不断发展,几种文库构建方法已经建立,并得到了较为广泛的应用．本文重点阐述了全长cDNA文库的构建方法,对各种方法进行了分析和比较;同时对全长cDNA文库的应用也作了介绍．     

褐飞虱取食水稻幼苗cDNA文库的构建及筛选

以褐飞虱取食 3 2 h的水稻幼苗为材料构建了 c DNA文库 ,初始文库含 3 .2× 1 0 6 个克隆 ,重组率为 86%,取 1 .0× 1 0 6个克隆子扩增一次 ,收集到 80 m L滴度为 1 .2× 1 0 9pfu/ m L的扩增文库 .随机挑取 2 0个克隆以 T7和 M1 3 reverse为引物进行 PCR扩增 ,以鉴定插入片段的大小 ,结果发现多数片段的长度在 1～ 4.0Kb左右 ,少数片段在 4Kb以上 ,个别片段在 6Kb左右 .以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的 ESTBp Hi0 0 8为探针 ,筛选 c DNA文库 ,得到该基因的 c DNA全长     

SMART法构建蚕豆全植株cDNA文库

采用了一种简单而快速的全长cDNA文库构建法,即SMART法,并应用cDNA片段与质粒共转化大肠杆菌的方法,成功地构建了蚕豆全植株cDNA文库.     

水稻全长均一化cDNA文库构建及SDG725结合蛋白筛选

为了筛选水稻组蛋白甲基转移酶SDG725的结合蛋白,构建了水稻全长均一化cDNA文库,以SDG725C末端为诱饵蛋白对cDNA文库进行筛选.最后筛选到70个可能与SDG725相互作用的蛋白,同时对筛选出的候选蛋白进行GO功能分析和亚细胞定位预测,并对部分蛋白与蛋白相互作用进行了验证.研究结果发现筛选到的结合蛋白有17%位于细胞核中,更多位于核外,为进一步研究SDG725的生物学功能提供理论基础.     

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1,R1),扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理,巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物,使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列,又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分;另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对,从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列,还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增,避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程,优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4,R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。     

从诸葛菜cDNA文库中筛选过氧化物酶基因

在200mmol／L NaCl诱导下构建诸葛菜苗期的cDNA文库,并从cDNA文库中筛选到一个新的过氧化物酶基因OvRCI,该基因cDNA全长1220bp,包含了一个1128bp的开放阅读框．通过同源分析比较及RT-PCR实验等对该基因进行了分析．结果显示该基因是一个诱导型表达的基因。     

加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆

以加工番茄８７－５为材料,运用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地将ＰＧ基因的ｃＤＮＡ序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,并利用酶切及ＰＣＲ进行了初步鉴定。     

忽地笑(Lycoris aurea)叶片cDNA文库的构建与分析

用表达型噬菌体载体ZAP构建了忽地笑叶片cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1 BLUE,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。初始文库的滴度为5.6×105pfu/mL,扩增文库的滴度为6.9×109pfu/mL,含插入片段的频率为96%,插入片段大小在0.5～2.5kb,文库质量良好。为进一步从基因组学和分子生物学方面研究忽地笑叶片发育及克隆相关全长基因奠定了基础。     

葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱蝇具有兼性滞育的特性且与果蝇近缘,是昆虫滞育分子机理和冬滞育和夏滞育专化基因比较研究的理想模式种,本研究目的在于构建葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂提取葱蝇非滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,将限制性内切酶SfiⅠ消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,转化入大肠杆菌(DH10B),获得原始文库。经过涂平板测定表明,原始文库的库容量为2.3×107个单克隆;随机挑取15个单克隆,通过PCR快速鉴定,插入片段大小在0.4~1.2 kb之间,平均大小在0.9 kb,重组率达100%。这些结果表明本研究所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

植酸酶基因表达与调控机制研究（Ⅰ）：发芽过程 …

分析了玉米和番茄种子发芽过程中麦活性的动态变化与无机磷酸释放量的关系。结果表明,植酸酶活性变化与贮藏态磷释放量密切相关,这种贮藏态营养的再动员对种子萌发和幼苗生长具有重要意义。     

番茄种子萌发初期产生的中性植酸酶的动力学特性研究

番茄种子萌发初期长根前产生的中性植酸酶的最适 pH在 7.2附近 ,在 55℃以内 ,酶活性随温度升高而增大 .其Km 是 10 4 μmol/L ,Vmax是 3.4 5nmol/ (min·L) .一价的Na和K离子对酶活性无影响 .二价的Ca、Mg、Cu和Zn离子有抑制酶活性作用 .酶保存在pH5.0时活性维持时间长     

用小鼠单个MⅡ卵和2-细胞期胚胎构建cDNA文库

阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种分离和克隆早期胚胎特异表达基因的有效方法.本研究利用小鼠单个MⅡ卵母细胞及发育至2-细胞的胚胎分别构建了cDNA文库.滴度分别为:6.5×106、7.2×107,基因片段平均长度为250-1500bp并用β-actin验证了文库的可靠性.这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法,不仅解决了胚胎研究材料受限制的问题,而且在材料的发育时间上更加精确,更能反映胚胎发育的规律,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎发育相关基因的一种有效手段.     

水稻成熟花粉cDNA文库的构建与分析

以λTriPIEx2^TM为载体,采用RT-PCR技术,构建了水稻成熟花粉的cDNA文库,此文库的滴度为1.2X1010pfu/mL,含插入片段的频率为97%,插入片段的大小为400bp-2500bp。     

一种改进的小非编码RNA cDNA文库构建方法

本文使用RNA Antisense Purification(RAP)技术富集纯化sncRNA,有效去除了5S、5.8SrRNA.联合使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)和RNA 5′Polyphosphatase处理sncRNA,将5′-端为非单磷酸结构的sncRNA转变成单磷酸结构,增加了文库覆盖率.在sncRNA3′-端添加poly(A)尾结构以及使用oligo(dT)16VN-adapter锚定引物进行逆转录,间接解决了sncRNA 3′-端接头定向连接问题,不再使用价格昂贵的腺苷化接头.改进后的sncRNA cDNA文库容量为3×105cfu,重组率为95%,且测序结果显示,获得的cDNA序列具有较好的完整性.使用这种成本低且行之有效的改进方法,为深入研究sncRNA奠定了基础.     

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.