基质金属蛋白酶的催化亚基——分子生物学在药物研究中的应用

近几年来,分子生物学的迅速发展为新药研究提供了理论基础,本文以对基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinases)催化亚基的研究为例,说明将分子生物学应用于药物研究的一条途径。基质金属蛋白酶是一类参与结缔组织更新的蛋白水解酶,与关节炎、肿瘤扩散转移、牙周炎等疾病有关,一些人的基质金属蛋白酶的催化亚基成功地在大肠杆菌中表达出来,用于酶抑制剂的随机筛选、酶或酶与抑制剂复合物的三维结构测定、酶与其抑制剂相互作用的结构活性关系研究,为得到新一代高亲合性、高选择性、高生物利用度的基质金属蛋白酶抑制剂作为药物打下了基础。     

纤粘连蛋白-整合素相互作用启动胚泡中基质金属蛋白酶活性

纤粘连蛋白是一种主要的细胞外基质,能够与整合素相互作用,介导胚泡的粘附和扩展．首次发现与纤粘连蛋白共同培养的小鼠胚泡产生基质金属蛋白酶－２和－９;若无纤粘连蛋白,小鼠胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转导通路中的关键信号分子,其反义寡聚脱氧核酸显著抑制纤粘连蛋白诱导的胚泡基质金属蛋白酶活性．结果表明,纤粘连蛋白可能通过其整合素受体的信号转导通路,启动小鼠胚泡基质金属蛋白酶－２和－９的表达,协调胚泡的侵入能力和子宫内膜的接受能力,从时间和空间上保证植入相关事件的准确性．     

基质金属蛋白酶-26(MMP-26)在小鼠胚胎植入过程中的作用

基质金属蛋白酶-26（MMP-26，又称Endometase或基质水解素-2）是MMPs家族的一个新成员，它可在胎盘，子宫以及不同肿瘤细胞系中表达，采用子宫角注射，免疫组化，原位杂交，胚泡与子宫上皮单层培养，免疫印迹，RT-PCR和RNA印迹等多种体内外实验方法研究并报道了MMP-26在小鼠胚胎中的表达以及MMP-26抗体在胚胎植入中的作用，研究表明，MMP-26的mRNA与蛋白在小鼠胚泡中均有强烈的表达，此外，体内研究显示，MMP-26抗体能显著抑制小鼠胚胎的着床；在体外培养体系中，MMP-26抗体可显著抑制小鼠胚泡在子宫上皮单层上的黏附与扩展；同时，MMP-26抗体以剂量依赖关系抑制整合素αV亚基mRNA和蛋白的表达，研究提示，MMP-26可能直接或间接参与滋养层细胞侵入子宫内膜的过程，促使小鼠胚泡成功植入。     

基质金属蛋白酶(MMPs)在人滋养层细胞侵入中的作用

基质金属蛋白酶(MMPs)及其天然组织型抑制分子TIMPs是调节许多生理和病理过程中细胞外基质(ECM)有序降解和重塑的重要分子. 胎盘形成(placentation)是妊娠期间的一个重要事件, MMPs/TIMPs系统在调节胎盘中绒毛外细胞滋养层细胞(EVTs)的节制性侵入中发挥重要作用. 本文综述了近些年MMPs/TIMPs家族成员在胎盘中的表达情况及多种因素(物理性因素、激素、细胞因子和生长因子等)通过影响MMPs/TIMPs系统的平衡对滋养层细胞侵入程度的调节. 最后, 对MMPs/TIMPs系统在治疗某些妊娠性疾病如先兆子痫、胎儿宫内生长抑制和绒毛腺癌等的应用前景进行了展望.     

基质金属蛋白酶-2,-9及其组织抑制因子在恒河猴黄体中的表达

基质金属蛋白酶（MMPs)及其组织抑制因子（TIMPs)在黄体形成和退化过程中发挥着重作用。实验目的在于研究MMP家族成员中的明胶酶及TIMPs在恒河猴月经周期新生和退化黄体以及妊娠早期黄体中的表达。收集排卵后第5,15天及妊姑第12,18和26天的卵巢,原位杂交显示,MMP-2mRNA在黄体形成和退化时均有表达,而MMP-9mRNA主要出现在黄体晚期。妊娠时MMP-2,-9mRNA的水平显著降低。妊娠第26天黄体中已检测不到MMP-2mRNA的表达。TIMP-1mRNA在黄体早期和晚期都有较高水平的表达,并持续于早期妊娠的各阶段。TIMP-2mRNA在黄体早期和晚期均表达,随着妊娠时间的进展,其表达呈逐渐增强趋势。在恒河猴黄体中未能检测到TIMP-3mRNA的杂交信号。结果提示,MMP-2,-9和TIMP-1,-2可能在恒河猴黄体功能调控中具有重要作用。MMP-2,-9与TIMP-2可能通过其协同表达而共同参与妊娠早期黄体功能的维持。TIMP-1mRNA稳定的表达模式提示其可能在灵长类黄体中发挥着抑制MMPs以外的其他功能。     

膜基质金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制因子-1在早期胎盘中的表达及其功能的研究

用原位杂交方法研究了人早期胎盘中膜型金属蛋白酶(MT-MMP-1)和金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的分布. 结果表明: (1) 在绒毛滋养层细胞和与其邻近的蜕膜细胞中MT-MMP-1和TIMP-1的表达量相对较高; (2) 在基底盘,Rohrs和Nitabuch纹间的外绒毛膜滋养层细胞, 滋养层和蜕膜的腺体细胞表达最高; (3) 胎膜分离层和绒毛干的少量细胞滋养层细胞以及蜕膜和绒毛干的血管壁上有明显的MT-MMP-1和TIMP-1的表达. 结果提示, 胎盘不同细胞MT-MMP与其抑制因子TIMP-1的协同表达在早期胎盘滋养层浸入和血管发生中发挥重要作用; 同时, 两者可能对在临产时在母体与胎儿的分离机制中也起某种作用.     

血管内皮生长因子对小鼠胚胎植入过程中基质金属蛋白酶的影响

血管内皮生长因子（VEGF）是内皮细胞的特异性致裂原，在血管发生和血管生成过程中占有重要地位，近年来发现，VEGF对胚胎植入也具有一定作用。但有关VEGF与植入中标记分子MMPs之间的关系，迄今未见报道，因此，研究目的是阐明VEGF在小鼠胚胎植入过程中对MMPs的影响，半定量RT-PCR的结果表明，VEGF抗体可显著抑制小鼠子宫MMP-2和-9mRNA的表达；将小鼠胚泡培养于FN铺碟的培养液中，同时用不同浓度的VEGF抗体孵育胚泡，通过明胶酶谱分析检测发现，0.1和1μg/mL的VEGF抗体能明显降低胚泡分泌的MMP-2和-9水解明胶活性的能力，以上结果提示，VEGF抗体可干扰子宫内膜或胚泡MMP-2和-9的基因表达和蛋白分泌，使滋养层细胞向子宫内膜的侵入能力或者子宫内膜接受胚泡的能力降低，影响胚胎植入过程。     

焦点黏着激酶对胚泡黏附、扩展和基质金属蛋白酶的调节

细胞外基质-整合素相互作用能显著影响胚泡的黏附、扩展和分化, 并能增强胚泡中尿激酶型纤溶酶原激活因子的表达, 因而是胚泡植入的关键因素之一. 焦点黏着激酶(FAK)是细胞外基质-整合素信号转导通路的基础分子. 研究发现, 胚泡表达FAK, 在扩展的滋养层细胞中呈斑点状分布, 在内细胞团中呈弥散分布. FAK的反义寡聚脱氧核酸(ODN)以剂量依赖方式抑制胚泡中64 kD 基质金属蛋白酶-2的活性. 这两种酶活性随反义ODN浓度升高而急剧减弱. 胚泡黏附和扩展也受到FAK反义ODN的影响. 当反义ODN浓度低于20 μg/mL时, 其对胚泡黏附和扩展的抑制作用具有明显剂量依赖关系, 但浓度达到200 μg/mL 时, 胚泡黏附率和扩展率反而回升至正常水平. 研究结果说明, FAK可能通过胞内信号转导通路影响胚泡黏附、扩展和基质金属蛋白酶-2活性, 从黏附和侵入两方面调节胚泡植入.     

基质金属蛋白酶-2, -9及其组织抑制物TIMPs mRNA在大鼠黄体中的表达及调节

研究了大鼠卵巢黄体中基质金属蛋白酶-2，-9（MMP2-，-9）及其组织抑制物TIMP-1，-2，-3mRNA的表达及调节。给26日龄大鼠注射阴云马务清每只50IU，48h后每只注射人绒毛膜促性腺激素致成假孕。经检测，证实假孕第1天黄体中MMP-2，-9mRNA的表达水平均最高，第4天开始下降，以后逐渐降低，到第14天表达降低到最低水平；TIMP-1 mRNA的表达在假孕第1天最高，第4天开始下降，第8天降低到最低水平，而后在假孕第14天表达又增加：IMPP-2mRNA的表达在第1-14天的假孕过程中没有显著的变化；与TIMP-1，-2表达相比，TIMP-3 mRNA的表达在假孕第1天最低，第4天开始增加，第8天达到最高，且一直持续到第14天，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可显著增加离体卵巢灌流假孕大鼠黄体中MMP-2，-9mRNA的表达，显著刺激TIMP-1 mRNA的表达，而对TIMP-2 mRAN的表达无明显的刺激或抑制作用，但可显著抑制TIMP-3 mRNA的表达。上述结果提示，MMP-2，-9及TIMPs可能通过它僮的基因表达变化共同参与调节黄体功能和维持黄体结构。TNF-α显著增加离体卵巢灌流假孕大鼠黄体中MMP-2，-9及TIMP-1 mRNA的表达可能是抑制黄体退化的机制之一。     

膜基质金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制因子-1 在早期胎盘中的表达及其功能的研究

用原位杂交方法研究了人早期胎盘中膜型金属蛋白酶（ＭＴ－ＭＭＰ－１）和金属蛋白酶抑制因子－１（ＴＩＭＰ－１）的分布。结果表明：（１）在绒毛滋养层细胞和与其邻近的蜕膜细胞中ＭＴ－ＭＭＰ－１和ＴＩＭＰ－１的表达量相对较高;（２）在基底盘,Ｒｏｈｒｓ和Ｎｉｔａｂｕｃｈ纹间的外绒毛膜滋养细胞,滋养层和蜕膜的腺体细胞表达最高;（３）胎膜分离层和绒毛干的少量细胞滋养层细胞以及蜕膜和绒毛干的血管壁上有明显的ＭＴ－     

基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展中的表达差异分析

研究了基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展过程中的表达变化。用RT－PCR检测配对食管癌手术标本及食管癌早期活检组织中MMP20基因表达,用免疫组织化学染色和Western印迹检测表达的MMP20蛋白。发现MMP20基因在mRNA和蛋白质水平上均为食管部过表达,MMP20基因的表达在食管癌发生早期未见明显升高,在浸润癌期明显过高表达,提示在食管癌发展中MMP20过表达与癌细胞浸润相关,是食管癌演进过程中的晚期事件。     

纤维黏连蛋白与白血病抑制因子对小鼠胚泡基质金属蛋白酶基因表达的影响

采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）检测了纤维黏连蛋白（FN）及白血病抑制因子（LIF）对小鼠胚泡基质金属蛋白酶基因（MMPs)表达的影响。将胚泡分别加入以下4种胚泡培养液中培养：第1组用FN铺碟;第2组,无FN铺碟;第3组,无FN铺碟,加入20ng/μL白血病抑制因子（LIF）;第4组,用FN铺碟,加入20ng/μL白血病抑制因子（LIF）,然后分别应用MMP－2,－9的引物对经不同培养液培养,培养时间不同（分别为6,12和24h）的小鼠胚泡总RNA进行RT－PCR检测、电泳分析及克隆鉴定。结果显示,第1组培养12和24h的胚泡可产生MMP－2和MMP－9 mRNA;第3组培养24h的胚泡可产生MMP－2和MMP－9 mRNA;第4组,培养6,12和24h的胚泡均可产生MMP－2和MMP－9 mRNA;而第2组培养6,12和24h的胚泡均无MMP－2和MMP－9 mRNA产生。以上结果表明,FN可能通过其整合素受体的信号转导通路,启动MMP－2,MMP－9基因转录mRNA;另外LIF对MMPs mRNA的表达也有一定的促进作用,它们共同协调胚泡的侵入能力和子宫内膜的接受能力,保证植入的准确性。     

基质金属蛋白酶系统与卵巢功能调节

哺乳动物的大多数器官在形成后,极少出现周期性的组织重建.然而,雌性动物的生殖系统,包括子宫内膜、乳腺、卵巢卵泡和黄体等在生殖周期或生命过程中的不同阶段经历着生长、成熟和萎缩等周期性变化.这些动态组织的变更要求细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的不断重建.ECM成分包含蛋白和非蛋白分子,它们形成具有组织特异性的细胞黏附结构.其中基质蛋白与其细胞受体的相互     

纤粘连蛋白-整合素相互作用启动胚泡中基质金属蛋白酶活性

纤粘连蛋白是一种主要的细胞上基质,能够与整合素相互作用,介导胚泡的粘附和扩展,首次发现与纤粘连蛋白共同培养的小鼠胚泡产生基质金属蛋白－２和－９;若无纤粘连蛋白,小鼠胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转号分子,其胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转导通路中的关键信号分子,其反义寡聚脱氧核酸显著抑制纤粘连蛋白诱导的胚泡基质金属蛋白酶活性。结果表明,纤     

基质金属蛋白酶-28在人细胞滋养层细胞与绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞中的表达

细胞滋养层细胞和肿瘤细胞的侵入行为具有惊人的相似性，其中基质金属蛋白酶（MMPs）是滋养层细胞和肿瘤细胞侵入的非常重要的介导因素。近来，MMPs家族的一个新成员－MMP－28被克隆并确定下来，采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）、酶谱分析和Northern blot等方法，检测了妊娠早期细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系JEG－3细胞中MMP－28的基因表达和蛋白分泌情况。RT－PCR显示，细胞滋养层细胞JEG－3细胞均有MMP－28mRNA的表达；Northern blot研究显示，JEG－3细胞中MMP-28mRNA的表达强于细胞滋养层细胞中MMP－28mRNA的表达，具有时间依赖关系；酶谱分析显示，JEG－3细胞中MMP－228蛋白分泌 活性高于细胞滋养层细胞中MMP－28蛋白分泌活性，呈时间依赖关系，这与MMP－28的基因表达结果相一致。进一步证明了MMP－28可能在正常妊娠和肿瘤发展等一些与组织重建有关的过程中发挥一定的作用。     

枯草杆菌中性蛋白酶与无机金属化合物相互作用的核磁共振谱

利用＾１Ｈ ＮＭＲ谱研究枯草杆菌中性蛋白酶与无机金属化合物间的相互作用结果发现,原酶活性中心金属离子Ｚｎ（Ⅱ）可以与外加ＣｏＣｌ２,ＮｉＣｌ２发生直接相互作用,被Ｃｏ（Ⅱ）Ｎｉ（Ⅱ）部分换而生成了酶的Ｃｏ（Ⅱ）,Ｎｉ（Ⅱ）取代衍生物;获得了该酶的两种金属取代衍生物的＾１ＨＮＭＲ谱图,同时论证了该酶活性中心的配位结构。     

几个重组蛇毒金属蛋白酶的表达、重折叠及其生物学活性

皖南尖吻蝮蛇毒出血金属蛋白酶acutolysin A除了具有引起动物皮下出血的活性外, 还具有降解纤维蛋白原和纤黏连蛋白的活性. 将acutolysin A以及非出血金属蛋白酶BR的cDNA分别克隆到原核表达载体pET-22b中, 并在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了这两个重组蛇毒金属蛋白酶, 即A-22b和BR-22b. 经变性和复性处理后, A-22b具有明显的出血活性, 但没有对纤维蛋白原和纤黏连蛋白的水解活性; 而BR-22b没有出血活性, 却具有降解纤维蛋白原的活性. 此外, 通过PCR方法构建了两个嵌合体基因C1和C2. C1是由BR基因的5′端330 bp和acutolysin A的3′端285 bp构成的嵌合体基因; C2是由acutolysin A基因的5′端324 bp和BR的3′端336 bp构成的嵌合体基因. 将它们克隆进表达载体pET-22b中得到两个表达质粒, 即pC1-22b和pC2-22b. 并以包涵体的形式表达了相应的两个重组蛋白, 即C1-22b和C2-22b. 经同样的变性和复性处理后, C1-22b与BR-22b类似, 具有较强的纤维蛋白原水解活性, 但没有出血活性. 与A-22b相似, C2-22b具有出血活性但没有对这些蛋白的水解活性. 这些结果暗示, 蛇毒金属蛋白酶的N端主亚结构域在出血活性上很可能起关键作用并极大地影响酶对底物的选择性.     

LeY对小鼠胚泡和子宫上皮细胞分泌MMPs的影响

以单克隆抗体ＡＨ６［特异结合Ｌｅ＾Ｙ寡糖,Ｆｕｃ α１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ－］为工具,采用明胶酶谱法,研究细胞表面的Ｌｅ＾Ｙ寡糖抗原与羊床期间小鼠胚泡和单层子宫上皮细胞分泌基质金属蛋白酶（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ,ＭＭＰｓ）之间的关系,从而进一步确定Ｌｅ＾Ｙ寡糖抗原在着床过程中的具体作用环节。结果显示,不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的     

用塑料纳米氧化锡铸造金属物体

传统的以高温熔化金属并用之锻造用具的历史已有数千年了。眼下,一个化学研究小组发明了一种工艺,可将细小的金属颗粒合成为可以造型和入火铸造的物体,就如陶工将粘土塑造成陶器一样——烧制的温度仅比室温略高——由这种工艺塑造的物体,可以是单一的金属,也可是多种金属的合金,可以适合于多种用途,包括催化和光学方面。     

Le~Y对小鼠胚泡和子宫上皮细胞分泌MMPs的影响

以单克隆抗体AH6 [特异结合LeY 寡糖 ,Fucα1_2Galβ1_4 (Fucα1_3)GlcNAc_]为工具 ,采用明胶酶谱法 ,研究细胞表面的LeY 寡糖抗原与着床期间小鼠胚泡和单层子宫上皮细胞分泌基质金属蛋白酶 (Matrixmetalloproteinase ,MMPs)之间的关系 ,从而进一步确定LeY 寡糖抗原在着床过程中的具体作用环节 .结果显示 ,不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的LeY 寡糖抗原被封闭后 ,都能导致MMPs的分泌减少 ,说明在LeY 寡糖抗原对胚胎着床过程的调节中 ,MMPs起着重要的作用 .认为LeY 寡糖抗原不仅参与胚泡和子宫内膜的识别 ,也通过某种机制调节胚胎着床的侵润过程