PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。     

单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达

为了探究从新疆发病绵羊中临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2)srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达,本研究利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后并进行序列比对分析,将其克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为1个分子量为47 ku的融合蛋白,与预期的大小相符合,成功的构建了重组质粒p ET32a-srt A,并使其在BL21(DE3)中获得了高效的表达。本研究为下一步研究其对李斯特菌致病性的影响及制备单克隆抗体奠定了基础。     

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究

以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.     

AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备

构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2,表达质粒在E.coliBL21中诱导表达,获得His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫,新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,West-ern blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

HIV-1C亚型DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的研究

 构建含中国流行株HIV-1 C亚型核心蛋白gag基因的重组质粒pVAX-gag,并在体外进行了表达与鉴定.同时构建了含此gag基因的原核表达质粒pGEX-gag,表达纯化并鉴定重组蛋白Gag.以质粒pVAX-gag免疫Balb/C小鼠后,用ELISpot和流式细胞仪检测其细胞免疫反应.再以纯化后的重组蛋白Gag作为包被抗原,用ELISA检测其体液免疫反应.结果显示重组质粒pVAX-gag免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,且免疫剂量和免疫效果存在一定的正相关性.重组原核表达质粒pGEX-gag的表达产物能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应,可用于抗HIV抗体检测.     

食管癌相关基因2(ECRG2)包涵体的溶解与纯化

采用生物工程的手段,用插有食管癌相关基因2(ECRG2)开放阅读框(ORF)的原核表达质粒pEGX-4T-1转化大肠杆菌E.coli,诱导表达了重组的GST-ECRG2融合蛋白;收集GST-ECRG2融合蛋白包涵体,经SKL溶解后在PBS中透析复性,用GST亲和层析柱纯化,从而获得一定数量的高纯度重组ECRG2蛋白.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白L基因片段的克隆及高效表达

 采用PCR方法扩增HSV-1病毒型特异性包膜糖蛋白L(gL)基因片段并克隆至原核表达载体pGEX-5X-1获得重组质粒pGEX-5X-1-gL,将重组质粒转化E.coli BL21表达菌后经IPTG诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE蛋白检测表明,在分子质量56 ku处有HSV-1 GST-gL融合蛋白的高效表达,通过IPTG浓度筛选和诱导前表达菌扩增培养时间的比较分析对诱导条件进行了优化,GST-gL融合蛋白表达量可达到菌体蛋白总量的48.65%.Western blot中利用HSV-1灭活病毒获得的多克隆抗体确证所表达蛋白为HSV-1病毒组分.这一表达系统的建立和优化对进一步探讨HSV-1 gL蛋白功能及其免疫原性提供了有利条件.     

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.     

ASP—ChIFN-α融合基因的构建及表达

利用PCR技术从宁夏地方三黄肉鸡肝组织中扩增出α干扰素基因,构建成原核重组表达质粒pET-28a/(ChIFN-α从埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(L-Asmraginase,ASP)信号肽基因,并与原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α连接,构建成分泌型表达重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α将重组质粒经IPTG诱导5 h.用SDS-PAGE分析表达蛋白含量,并用鸡α-干扰素ELISA(Western-blot)试剂盒检测表达的重组蛋白的特异性.结果表明,包涵体型重组质粒pET-28a/ChIFN-α和分泌型重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α在23 kD处均表达出目的蛋白,蛋白含量分别为27%和38%,pET-28a/ASP-ChIFN-α的蛋白表达含量比pET-28a/ChlFN-α的蛋白表达含量要高出11%,表达的重组蛋白具有特异性.实验实现了鸡α-干扰素成熟蛋白基因的高效表达,筛选出了可应用于临床的鸡α-干扰素高效表达菌株BL21(DE3)(pET-28a/ASP-ChIFN-α).     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

小鼠睾丸特异表达新基因(mtLR1)在大肠杆菌中的表达

根据已经克隆的mtLR1基因序列,采用RT-PCR的方法获得mtLR1基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pMAL-P-2x中,得重组质粒(pMAL-P-2x/mtLR1)并转化大肠杆菌(E．coli)DH5α．经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,重组蛋白得到了正确表达,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的52％,分子质量约为73 kDa。mtLR1蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

基于青藤碱的抗风湿性关节炎分子构建的研究进展

利用PCR技术扩增出BmDNV-1结构蛋白vp4基因,并将该基因与原核表达载体pMALc2X进行连接,转化大肠杆菌DH10B.获得重组质粒经IPTG诱导表达得到大小为96 000的融合蛋白,融合蛋白经Amylose柱纯化,使用其免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体.从而为进一步研究该病毒结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具.