转“全鱼”生长激素基因鲤鱼及其F_1遗传分析

采用显微注射方法, 研制出转"全鱼"生长激素基因鲤鱼. 比较分析了转基因鲤鱼(P0)获得性状多样性, 筛选获得具有显著快速生长效应的转基因鱼个体; 繁殖力参数比较发现, 快速生长转基因鱼的繁殖能力无实质改变. 对F1转基因鱼转植基因分离和性状分布进行了遗传分析, 结果证实转植基因在2, 3条染色体上整合, 转植基因不同整合位点的生物学效应存在差异, 这为快速生长转基因鱼育种奠定了基础.     

转“全鱼”生长激素基因鲤鱼及其F1遗传分析

采用显微注射方法,研制出转“全鱼”生长激素基因鲤鱼,比较分析了转基因鲤鱼（P0）获得性状多样性,筛选获得具有显著快速生长效应的转基因鱼个体;繁殖力参数比较发现,快速生长转基因鱼的繁能力无实质改变,对F1转基因鱼转植基因分离和性状分布进行了遗传分析,结果证实转值基因在2,3条染色体上整合,转植基因不同整合位点的生物学效应存在差异,这为快速生长转基因鱼育种奠定了基础。     

非离子态氨对转“全鱼”生长激素基因鲤鱼的急性毒性和慢性毒性

在自然水体和人工水体中氨氮对鱼类是有毒的. 利用静水更新式生物测试研究了非离子态氨对转基因鲤鱼和对照鱼的96 h急性毒性实验和21 d慢性毒性实验. 通过96 h非离子态氨急性毒性实验发现, 转基因鲤鱼的非离子态氨氮24, 48, 72和96 h半数致死浓度(LC₅₀) (2.64, 2.44, 2.28和2.16 mg/L)分别比对照鲤鱼相应的24, 48, 72和96 h半数致死浓度(LC₅₀) (2.70, 2.64, 2.52和2.33 mg/L)略低, 没有显著性差异; 但在不同非离子态氨氮(3.86, 3.29和2.09 mg/L)胁迫下, 转基因鲤鱼的半数致死时间(LT₅₀) (1.41, 7.91和117.42 h)分别显著性短于对照鱼的半数致死时间(2.53, 14.06和150.44 h). 21 d非离子态氨慢性毒性实验发现, 在不同非离子态氨氮浓度(0.91 ± 0.12, 0.48 ± 0.06和0.12 ± 0.01 mg/L)胁迫下, 转基因鲤鱼的死亡率均显著性高于对照鲤鱼. 上述研究表明, 转基因鲤鱼对氨氮胁迫的耐受能力比对照鲤鱼差, 为客观评价转生长激素基因鲤鱼潜在生态风险, 并为今后确定转GH基因鱼集约化养殖的密度和制定养殖水体氨氮安全指标提供了重要的科学参数.     

转入生长激素基因红鲤F_2代阳性鱼的摄食及代谢研究

生长激素(GH)是由中腺垂体分泌的多功能激素,对动物生长的促进效应已无可置疑.将冠以小鼠重金属螯合蛋白(MT-1)基因启动顺序的人生长激素(hGH)基因重组质粒pMThGH显微注射到红鲫(Carassius auratus auratus)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)的受精卵内,获得了第一批转基因鱼,并进一步证实了转移基因的整合、表达、传代及转GH基因鱼的快速生长效应.由于鱼类自然群体中也存在个别的快速生长个体,对转GH基因鱼快速生     

快速生长导致转“全鱼”生长激素基因鲤鱼临界游泳速度的降低

进化生物学研究表明, 快速生长赋予生物的优势与劣势之间存在权衡. 硬骨鱼类的生长率与游泳能力之间也存在这种权衡. 本研究提出假说认为, 快速生长将导致转基因鱼游泳能力减弱. 比较F3代转“全鱼”生长激素基因黄河鲤与其对照鱼的生长和临界游泳速度, 表明转基因鱼的平均体重是对照鱼的1.4~1.9倍, 平均特定生长率比对照鱼高出6%~10%, 而其绝对临界游泳速度和相对临界游泳速度的平均值分别比对照鱼低 22%和 24%. 本研究暗示, 具有快速生长效应的转基因黄河鲤表现出低劣的游泳能力, 这也证实了生长率和游泳能力之间存在权衡, 即同一物种的个体生长率越高, 临界游泳速度则越低.     

转生长激素基因三倍体鲤鱼的快速生长与不育特性

将转草鱼生长激素基因黄河鲤(♂)与改良四倍体鲫鲤(♀)交配, 获得100%三倍体子代“鲤鱼”. 通过特异引物PCR检测, 子代鲤鱼包括转基因(简称阳性鱼)和非转基因(简称阴性鱼)两部分, 其中阳性鱼占总检测鱼数的44.2%; 染色体检测表明, 子代转基因鲤鱼的染色体数目为3n=150; 组织切片结果表明性腺不能发育成熟; 在同龄的鲤鱼繁殖季节(24月龄), 转基因三倍体鲤鱼仍不能产生成熟配子. 阳性和阴性三倍体鲤鱼在形态上无明显差异, 它们的体侧扁, 近似纺锤形, 体色青灰, 有两对口须, 大部分可测量性状和可数性状都介于父母本之间, 表现出杂种特征. 2年同塘养殖结果表明, 阳性鱼的平均体重为阴性鱼的2.3倍; 其中最大阳性鱼个体的体重为最大阴性鱼的2.91倍. 因此, 本研究不仅证实了转基因三倍体鲤鱼的生长快速特性, 而且第一次用实验消除了转基因鲤鱼养殖应用上的生态安全之虑.     

鱼类性腺发育调控的生物技术应用前景分析

性腺是脊椎动物精卵发生的场所, 是生命繁衍的关键器官. 本文评述了通过调控特定基因表达与鱼类性腺发育, 培育性腺发育被完全抑制的转反义GnRH基因鲤鱼、特异剔除鱼类性腺中的转植基因以及在鱼类性腺中特异表达外源基因的研究进展, 认为鱼类性腺有望发展成为一种实施生物技术操纵的新型载体, 并探讨了鱼类性腺发育调控在转基因鱼的遗传生态安全对策研究以及新型生物反应器的研制等方面的应用前景.     

鱼类性腺发育调控的生物技术应用前影分析

性腺是脊椎动物精卵发生的场所,是生命繁衍的关键器官.本文评述了通过调控特定基因表达与鱼类性腺发育,培育性腺发育被完全抑制的转反义GnRH基因鲤鱼、特异剔除鱼类性腺中的转植基因以及在鱼类性腺中特异表达外源基因的研究进展,认为鱼类性腺有望发展成为一种实施生物技术操纵的新型载体,并探讨了鱼类性腺发育调控在转基因鱼的遗传生态安全对策研究以及新型生物反应器的研制等方面的应用前景.     

小鼠胸腺基质细胞诱导Pre—T细胞的分化

体内重建试验证明,骨髓来源的 Pro-T 细胞,在胸腺内经历多阶段的发育,分化为对自身抗原耐受、对外来抗原应答的功能成熟 T 细胞,迁出胸腺.经嵌合小鼠及转基因小鼠研究证明,胸腺微环境基质细胞(TSC)对胸腺内 T 细胞的发育,有选择作用,阳性选择导致 T 细胞功能发育,阴性选择导致 T 细胞克隆消除或不活化.鉴于 TSC 类型的多样性,很难分析胸腺内起选择作用的细胞类型及分子机理.为此,体外建立 TSC 系,在体外培养中,分析已知类型的 TSC 对特定发育阶段的 T 细胞分化的作     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

抑制CCoAOMT表达的转基因杨树的制浆性能

检测了生长3年的转反义CCoAOMT基因杨树(Populus tremula × Populus alba)的制浆性能. 该株系木质素含量比野生型对照下降约13%, G/S略有增加. 化学成分分析表明, 转基因杨树的灰分含量、冷水抽提物、热水抽提物、1% NaOH抽提物、综纤维素、戊聚糖及纤维素含量与野生型对照没有明显差别, 但转基因杨树的苯醇抽提物含量略有增加. 纤维特征分析表明, 转基因杨树的纤维品质有所提高. 实验室小规模制浆实验表明, 降低木质素含量可以明显改善转基因杨树的制浆性能, 表现为木质素更易于去除、纸浆得率增加和纤维聚合度提高.     

鸡生长激素基因单核苷酸多态与生长及屠体性状的相关性

以鸡生长激素(GH)基因作为控制鸡生长和屠体性状主基因的候选基因, 以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, 通过PCR-RFLP方法对GH基因进行多态性检测. 在该基因内含子3中发现1处碱基突变: G →A, 由内切酶EcoR Ⅴ酶切证实; 在内含子4中发现1处碱基突变: C→T, 由内切酶MspⅠ酶切证实, 并由此对F₂代鸡群个体进行基因型鉴定. 方差分析结果显示, 在内含子3中的碱基突变与腹脂性状显著相关; 内含子4中的碱基突变与腹脂、胸肉屠体性状显著相关, 但两处突变与其他大部分生长和屠体性状相关不显著, 结果表明鸡GH基因可能是控制某些屠体性状的主基因, 或与控制这些性状的主基因紧密连锁.     

分泌改善的重链促进基于蛋白内含子的双载体共转全长FVⅢ基因

在甲型血友病基因治疗中, 其疗效受FVⅢ的低分泌性和较大的FVⅢ基因难以为腺相关病毒(AAV)载体运载等因素的不利影响. 研究表明, 重链的分泌低下是导致FVⅢ分泌低效性的主要原因. 我们最近的研究表明, 应用蛋白质剪接技术的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因, 通过表达后重链和轻链的共价连接, 轻链可顺式促进剪接BDD-FVⅢ的分泌, 但重链分泌的低下影响分泌的水平. 本文将具有促进FVⅢ分泌作用的L303E/F309S点突变引入FVⅢ的重链, 通过蛋白质剪接的双载体共转断裂全长FVⅢ基因, 观察了重链和剪接全长FVⅢ的分泌和生物活性的变化. 构建了一对融合Ssp DnaB蛋白内含子(intein)的突变重链和轻链真核表达载体, 瞬时共转染培养的COS-7细胞, Western blotting结果表明转基因细胞有明显的剪接FVⅢ蛋白表达; 突变重链单独转基因后的分泌量为(39±11) ng/mL, 明显高于野生型重链的分泌量; 与轻链共转基因的重链分泌量增加到(123±13) ng/mL, 培养上清中分泌的剪接FVⅢ量和活性分别为(86±14) ng/mL和(0.61±0.08) IU/mL, 明显高于断裂的野生型FVⅢ共转基因. 另外, 转突变重链和轻链基因细胞的合并培养上清中亦检测到剪接的FVⅢ蛋白和生物活性, 且高于转野生型重链和轻链基因细胞的合并培养上清. 结果表明, 重链分泌性的改善可提高运用蛋白质剪接技术的双载体转断裂的全长FVⅢ基因的功效, 为动物体内进一步运用双AAV载体转全长FVⅢ基因提供了实验依据.     

乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在海带中的表达

用自建的海带模式转化体系,以基因枪转化法获得转乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因海带.转基因海带HBsAg蛋白的平均表达量为0.529μg·（mg可溶性总蛋白）-1,最高可达2.497μg·（mg可溶性总蛋白）-1,且表达产物具有天然表位（epitope）.经PCR-Southern,总DNA的Southern blot及ELISA定量检测证明,外源基因已发生整合并已正常表达.通过表达水平的横向比较,提示转基因海带生产乙肝疫苗具有开发潜力,海带作为大型海藻表达系统,有望在高附加值产品生产与海洋环境保护方面发挥独特作用.     

在拟南芥中OsRAA1异位表达促进开花及下胚轴伸长

OsRAA1 (Oryza sativa root architecture associated 1)是拟南芥AtFPF1在水稻中的同源基因, 参与水稻根发育的调控. 将OsRAA1在拟南芥中异源超表达, 发现转基因拟南芥的开花时间提前, 同时发现在光照条件下转基因拟南芥的下胚轴长度增加. 进一步分析表明, 在蓝光、远红光和黑暗条件下转OsRAA1拟南芥下胚轴长度和野生型没有明显区别, 但在红光条件下, 转基因拟南芥的下胚轴长度是野生型的两倍. 转AtFPF1拟南芥也表现出类似的表型, 说明OsRAA1/AtFPF1蛋白不但可以调控拟南芥开花时间, 而且参与红光对下胚轴的光抑制过程, 它们在进化过程中保留了这两方面的功能.     

利用土壤农杆菌将天花粉蛋白基因转入水稻植株并检测抗稻瘟病活性

通过土壤农杆菌方法将天花粉蛋白基因转化到水稻中, 获得了具有单拷贝外源基因插入和表达的水稻再生植株. 抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)检测发现, 接病菌后1个月内转天花粉蛋白基因植株在发病时间、发病植株数、发病叶片、发病后的植株生长状况等各项指标上与对照的转GUS基因植株比较均有较大差异. 在去除高湿度的发病环境后, 转天花粉蛋白基因植株的生长情况也明显优于对照植株. 表明转基因水稻对稻瘟病侵害至少有明显的延迟发病抗性. 天花粉蛋白基因在水稻中的表达未发现对宿主植物生长有明显影响.     

体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础. 本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选, 以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体, 以体外成熟卵母细胞为核受体, 构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎, 并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究. 结果显示, 采用4.0 μL/mL脂质体转染试剂, 1.6 μg/mL质粒DNA, 转染6 h可以获得最佳的转染效果, 转染效率达3.61%; GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%, GFP阳性胚胎率为48%; 重构胚移植于10头受体后, 有5头妊娠, 3头受体发育到期, 共出生克隆猪6头, 其中4头为GFP阳性, 经DNA检测确认为GFP转基因猪; 转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%, 阳性个体出生率为0.7%. 结果表明, 脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞, 获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能. 本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.     

水稻穗顶退化突变体paa1331的鉴定及基因定位

水稻穗部是影响产量的重要农艺性状,其发育健全与否直接决定了水稻产量的高低.过去几十年已经有大量的粒型和穗粒数相关基因被克隆报道,但调控穗顶发育相关基因的克隆与功能的报道较少.本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种宜香1B,筛选到一个能稳定遗传的穗顶退化突变体材料paa1331(panicleapical abortion1331).与野生型相比,该突变体主要表现为穗顶端严重退化(退化率高达53%),株高变矮,分蘖减少,穗粒数降低.台盼蓝染色结果表明,穗顶端退化伴随细胞程序性死亡;激素测定结果证明,突变体穗顶部生长素含量高于野生型.遗传分析表明,该突变性状受隐性单基因控制;通过图位克隆与重测序分析发现,基因LOC_Os04g40720第4外显子的碱基A突变成G,导致编码的氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸.目前该基因未见报道,暂将该基因定为候选基因.     

调控水稻异倍性杂交种子败育的相关基因分析

MADS29是控制水稻(Oryza sativa L.)种子饱满程度的基因,它通过调控母体组织细胞退化和维持体内激素平衡来影响种子发育.水稻异倍性杂交往往产生败育种子,为了探讨MADS29等种子发育相关基因是否参与其调控,本研究以4份水稻材料(2个二倍体;2个四倍体)构建4个自交组合(对照)和8个杂交组合(正反交),对花粉粒育性、花粉管萌发及伸长、种子发育及MADS29等相关基因表达进行分析.结果表明:(1)异倍性杂交均可正常受精,但杂交种子败育;(2)石蜡切片结果显示,授粉后3 d(3 day after pollination,3 DAP),与对照相比,4n×2n胚乳已进入细胞化时期,但细胞数量较少;而2n×4n胚乳处于合胞体时期,游离核周围未形成细胞壁,胚乳细胞化时期滞后;(3)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)表明,6 DAP和8 DAP,MADS29、生长素基因和母体组织细胞程序化死亡(PCD)相关基因的相对表达量在杂交种子中均明显高于对照;淀粉合成基因在杂交种子中的相对表达量显著低于对照.本实验结果表明,在水稻异倍性杂交中,MADS29高表达,生长素基因和母体组织PCD相关基因表达上调,淀粉合成相关基因表达下调,导致胚乳发育异常、种子败育,说明MADS29的高表达导致异倍性杂交种子败育,是一种有别于二倍体水稻种子发育的新型调控方式.     

人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因在烟草中共表达对棉铃虫有更好的杀虫活性

利用叶盘转化法获得了携带Cry1Ac, Cry1Ie和同时携带这两个基因的3种类型转基因烟草. 利用ELISA法测定转基因烟草叶片中Bt蛋白含量, 在携带两种Bt基因的转基因烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白分别占总蛋白的0.173%和0.131%. 在携带单个基因的烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白的含量分别为0.182% 和0.124%. 分别用野生型棉铃虫(Helicoverpa armigera)和Cry1Ac抗性棉铃虫的初孵幼虫在这3种类型的转基因烟草叶片上进行虫试, 并以未转基因烟草为负对照. 实验结果表明, 携带Cry1Ie基因的转基因烟草对这两种棉铃虫都有杀虫活性, 而携带Cry1Ac基因的转基因烟草仅对野生型棉铃虫有抗性, 携带两种Bt基因的烟草比仅含其中一个基因的烟草对这两种棉铃虫均有更好的杀虫效果. 该结果表明, 这两种Bt基因在转基因烟草中能够协同作用, 提高了烟草对害虫的杀虫效果. 同时, 转入两个Bt杀虫基因有可能成为延缓农业害虫对转基因作物产生抗性的新途径.