兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

目的 建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法 本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域，设计3对特异性引物，以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度，构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量；以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性；通过批间和批内实验验证其重复性；经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较，评估其临床应用效果。结果 最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMD-Sa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高；该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带，对其他病原体均无扩增条带，表明特异性较强；...     

HBV C区基因扩增与PCR条件的优化

目的:为提高PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)的特异性和灵敏度,降低成本,对PCR条件进行优化.方法:将HBV特异性基因片段转化到大肠杆菌DH5α中,提取质粒,利用PCR扩增HBV C区基因,对PCR条件中的退火温度、Mg2 浓度进行优化,并比较3种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度.结果:HBV C区基因扩增的最佳退火温度为58℃,最佳Mg2 浓度为1.5mmol/L,Biostar Taq DNA聚合酶扩增到10-6.讨论:对HBV C区基因进行了转化和PCR实验条件的优化,为扩大PCR在乙型肝炎病毒(HBV)检测领域中的应用提供实验依据.     

犬细小病毒、犬冠状病毒和犬轮状病毒三重PCR方法的建立及初步应用

犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)、犬冠状病毒(Canine coronavirus, CCoV)和犬轮状病毒(Canine rotavirus, CRV)是引起犬腹泻的主要病原.3种病原引发的疾病临床症状相似,难以诊断,因此需要建立可以高效鉴别这3种病原的分子检测方法.通过对引物浓度、退火温度的条件优化,建立了可同时检测CPV、CCoV和CRV 3种病毒的三重PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可特异性扩增CPV VP2基因(253 bp)、CCoV ORF-1b基因(379 bp)和CRV VP6基因(852 bp)的目的片段,未检出其他相关病原;对CPV、CCoV和CRV的最低检测浓度分别为6.44×10^-1 pg/μL、8.72×10^-1 pg/μL和8.35×10^-1 pg/μL,方法的灵敏度高;重复性试验显示该方法具有良好的稳定性.应用建立的三重PCR方法对2019～2020年成都市区采集的135份犬腹泻粪便样本进行了检测,并与单重PCR检测结果相比较.结果显...     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系(引物为中国鲎微卫星引物).并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系:总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件:模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

正交试验法优化酰胺酶PCR条件

以Salinispora arenicola的总DNA作为研究材料,将正交实验法应用于聚合酶链式反应(PCR)上,探求4种主要因素(退火温度、退火时间、DMSO、引物量)在3个水平上的最佳使用量,迅速找到最佳PCR条件,为后续一系列实验铺平道路。实验得出10μL反应体系最佳PCR条件为:DMSO 0.6μL;引物0.6μL;退火温度56℃;退火时间20 s。经验证确定该条件能大大提高目标条带扩增量。     

正交设计优化山茱萸ISSR-PCR反应体系研究

利用正交试验设计法,从引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2 浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对山茱萸ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测.结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:1×PCR buffer、150 μmol/L dNTP、1.0 μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2 和2.0 U TaqDNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～80 ng,引物UBC835的最佳退火温度为57.2℃.     

用PCR扩增裸甲藻和微小原甲藻rRNA基因的方法研究

以赤潮种裸甲藻(Gymnodinium sp．)和微小原甲藻(Prorocentrum minimum)为试验材料，以不同方法提取其基因组并进行纯化，然后采用PCR方法扩增其rRNA基因，包括18S，28S和ITS片断，并进行扩增条件的比较和优化，得到两种藻的最佳DNA提取条件和PCR扩增条件．裸甲藻和微小原甲藻的DNA提取宜采用改良的CTAB方法；并需对粗提取的DNA用CTAB方法进行纯化．两种藻的最适模板浓度为纯化后模板1．0～2．0μL；最适Mg^2 浓度为2．0μL(25mmol／L)；ITS引物PCB扩增的退火温度为50℃，而18S三对引物的退火温度均为55℃，28S的退火温度为54℃最为适宜。     

朱鹮RAPD反应体系优化研究

目的研究朱鹮RAPD反应中Mg2 浓度、复性温度、引物浓度、Tag酶浓度和DNA模板量等几种因素对扩增结果的影响,并探讨反应的最优条件。方法以朱鹮DNA为材料进行RAPD试验,对Mg2 浓度、复性温度、引物浓度、Tag酶浓度和DNA模板量进行梯度设置,每次仅改变一个参数,并保持其他条件不变。结果建立了一套适用于朱鹮的RAPD反应体系。结论优化后的朱鹮RAPD反应条件为:反应总体积25μL,其中含Mg2 (25 mM)2.5μL,10×Buffer2.5μL,dNTPs(10mM)0.5μL,引物(8μmol/L)1.0μL,Tag酶(3 U/μL)0.4μL,DNA模板(10 ng/μL)3.0μL;PCR循环中复性温度为37℃。     

卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立

【目的】快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcus garvieae)4种主要的致病菌,为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。【方法】针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R,建立多重PCR反应体系,通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度,对反应体系进行优化及灵敏度测试。2014年6~8月,应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测,然后用通用引物扩增16SrRNA基因,经测序、比对检测体系的准确性。【结果】反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2μmol/L,0.08μmol/L,1.6μmol/L和0.4μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10~(-2) ng/μL;11份病原样品检测中,2份出现海豚链球菌的目的条带,4份出现无乳链球菌的目的条带,5份未见目的条带,和测序分析结果一致。【结论】多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌。     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

FAstV、FPV和FECoV三重PCR检测方法的建立及应用

猫星状病毒(Feline astrovirus, FAstV)、猫细小病毒(Feline parvovirus, FPV)、猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus, FECoV)是临床上引起猫腹泻的重要病原,为建立一种能同时鉴别三种病原的分子检测方法,通过对引物浓度和退火温度的条件进行优化筛选,建立了FAstV/FPV/FECoV的三重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证.结果表明,该方法可特异性扩增出FAstV(320 bp)、FPV(468 bp)和FECoV(664 bp)的目的片段,而未扩增出其它犬猫相关病原,且重复性好.FAstV、FPV和FECoV的最低检测限分别为2×10⁷copy/μL(7.1 pg/μL)、4.7×10⁶ copy/μL(2.4 pg/μL)和7×10⁶ copy/μL(5.1 pg/μL).应用建立的三重PCR方法对2019～2020年成都市区采集的207份猫粪便样本(141份腹泻样本,66份临床健康样本)进行检测,结果显示FPV、FA...     

仁用杏SRAP-PCR体系的正交设计优化

改良CTAB法提取仁用杏基因组DNA,用于建立SRAP-PCR体系。采用L16（44）正交设计试验,对影响仁用杏SRAP-PCR反应体系的4因素（dNTPs浓度、Mg^2＋浓度、引物浓度、Taq聚合酶量）4水平进行筛选,PCR结果经统计软件SPSS V13.0分析,并对退火温度进行了摸索,确立了仁用杏SRAP-PCR的优化体系：总体积为20 L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg^2＋浓度为2.5mmol/L,引物浓度为0.9μmol/L,Taq聚合酶量为1.5 U,退火温度为52℃。本优化体系为仁用杏资源遗传分析奠定了技术基础。     

ISSR在蝴蝶兰亲缘关系分析中的初步应用

通过对退火温度、镁离子浓度、聚合酶浓度等因素进行优化,建立了适合蝴蝶兰ISSR分析的优化反应体系,并将此体系用于分析22个蝴蝶兰品种/品系.从80个引物中筛选出14个引物,共扩增出188条片段(多态性条带比例为84%),表明供试品种/品系间具有丰富的遗传多态性.并且检测出了19条品系特异性条带,可用来鉴定供试蝴蝶兰中的11个品系.22个品种/品系在遗传距离L=0.254处可分为8个组,两个最大的组分别代表红色系和白色系,可见聚类情况与花色特征比较一致.     

实验动物金黄色葡萄球菌LAMP法快速检测

目的建立一种灵敏、高效,可用于实验动物金黄色葡萄球菌检测的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。方法针对金黄色葡萄球菌nuc基因(V01281.1)参考设计4条LAMP扩增引物,并选取常见实验动物致病菌进行引物特异性检测;通过优化LAMP反应体系中Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度及LAMP反应时间,确立LAMP反应最佳条件;本文采用LAMP法和PCR法对不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌以及用不同浓度金黄色葡萄球菌人工感染的粪样进行检测,比较两种方法的检测灵敏度。结果通过条件优化,本实验建立的LAMP法检测实验动物金黄色葡萄球菌的最佳反应温度为60℃,反应时间为50 min,优化后的LAMP反应体系为dNTP浓度2.0 mmol/L、Mg~(2+)浓度8.0 mmol/L、引物对FIP/BIP浓度1.6μmol/L、引物对F3/B3浓度0.2μmol/L,且与其它常见实验动物致病菌无交叉反应;对金葡菌纯培养物进行检测,LAMP法检测灵敏度为9CFU/反应管(9×10~3CFU/mL),PCR法检测灵敏度为9×10~1CFU/反应管(9×10~4CFU/mL),对人工接种金黄色葡萄球菌的SD大鼠粪样进行检测,LAMP法检测灵敏度为4.49×10~4CFU/0.1 g粪样,PCR法检测灵敏度为4.49×10~5CFU/0.1 g粪样。结论本实验建立的实验动物金黄色葡萄球菌LAMP检测方法,与PCR法,免疫学法和传统检测方法比较,具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点,可应用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

赤松ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立赤松ISSR-PCR反应体系,利用正交试验分别对影响赤松PCR反应的dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、Taq酶浓度、引物浓度、模板浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度和循环次数.最终确定赤松ISSR-PCR最佳反应体系及扩增条件为:25μL反应体系中含2.5μL 10×PCR Buffer、3 mmol·L~(-1)dNTP、1.5 mmol·L~(-1)Mg~(2+)、0.5 U Taq酶、0.3μmol·L~(-1)引物、9 ng模板;扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行94℃变性30 s,55℃退火45 s(退火温度随引物不同而变化),72℃延伸2 min,35个循环,最后72℃延伸7 min.这一ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR技术对赤松进行物种分类鉴定奠定了基础.     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好，与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系，方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰；该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

豌豆中抗寒相关性miRNAs功能特异性验证及其克隆的研究

以正常(对照)和寒冷诱导豌豆(Pisumsativum Linn)幼苗为研究对象,用已知模式植物拟南芥中抗寒性相关的4种miRNAs序列(miR319、miR393、miR397、miR402)设计引物,通过半定量PCR法,检测在豌豆中正常条件和寒冷诱导下可能出现的相关miRNAs.在此基础上,选取模式植物中已知的miR319序列,设计特异引物,寻找豌豆抗寒性相关的miRNAs.结果表明:miR319、miR393、miR397、miR402均存在于豌豆中,并且冷处理诱导下表达量都有所上升,此结果验证了抗寒性miR家族在植物间存在保守性的特点;特异性寻找克隆、测序结果表明,新的与抗寒性相关的miRNAs也存在于豌豆中.本研究建立的寻找或验证miRNAs的方法是可行的,并为在各种生物中miRNAs功能研究与应用打下良好基础.     

法夫酵母银染mRNA差异显示技术的建立

对影响银染DDRT-PCR方法的主要因素如RNA投入量、引物浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度以及二次扩增的退火温度进行优化.实验结果表明:适宜分析法夫酵母mRNA差异显示的银染DDRT-PCR的条件是总RNA投入量为0.4 μg、引物浓度为1.5 μmol/L、dNTPs浓度为0.25 mmol/L、MgCl2浓度为1.7 mmol/L、二次扩增的退火温度为40 ℃.     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

溶胶-凝胶法制备掺铝氧化锌透明导电膜的正交实验研究

采用溶胶-凝胶法制备了掺铝氧化锌(ZnO：Al,ZAO)透明导电膜。对薄膜用X射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)、四探针仪及紫外 可见分光光度计等分析测试手段进行了表征;通过正交实验探讨了溶胶浓度、铝离子的摩尔掺杂量以及退火温度等因素对其电阻率的影响。结果表明,薄膜电阻率随溶胶浓度、铝离子掺杂量的增加,呈现先减小后增大的趋势,并随退火温度的升高而减小,从而确定了制备ZAO透明导电膜的优化工艺条件为：溶胶浓度0.8mol/L,铝离子的掺杂量1.0%(摩尔分数),退火温度550℃。在优化工艺条件下制得的ZAO透明导电薄膜具有标准的ZnO纤锌矿结构,其电阻率为1.275×10^-3Ω·cm,平均透光率达84%。