猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的高效表达及其分离纯化

尝试利用毕赤酵母(pichia pastoris)表达体系大量生产制备猪胃蛋白酶,用化学的方法合成猪胃蛋白酶原A基因,并构建表达载体pGAPZα-pepsinogen;利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母x-33菌株的染色体上.经过发酵,三角摇瓶培养条件下获得的猪胃蛋白酶原A总酶活达5 250U/L.发酵液上清经过DEAE离子交换色谱和Sephacryl S-200分子筛色谱分离,活化酶原后测定其比活达到52 800 U/g.     

培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris,P .pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统 ,该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点 ,而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述     

利用转基因毕赤酵母高表达小分子药用多肽的研究

天然小肽Gsp有明显的降血糖功效,由59个氨基酸残基组成.其编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9-Gsp. 经电穿孔将该质粒转化为毕赤酵母GS115(His4- mut+),挑选His+ muts型菌株进行重组蛋白胞外表达研究.表达蛋白经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析确定了相对分子质量的正确性,其氨基酸测序显示与天然多肽序列一致,并经紫外扫描分析确定了表达量为344mg/L左右.     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的优化表达

尝试利用毕赤酵母的表达系统制备大黄鱼生长激素(Pseudoscraena crocea,growth hormone,pcGH).根据酵母偏好密码子设计优化的基因序列,通过化学方法合成pcGH基因,构建表达载体pPICZ A - GH,利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母X -33菌株染色体上并得以成功表达,...     

RACK1蛋白在毕赤酵母GS115中的表达研究

本文克隆得到了拟南芥和水稻的活化态C激酶1受体基因,AtRACK1/OsRACK1,用电转化的方法成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,经菌体培养和甲醇诱导后获得了有效分泌表达,表达产物存在于培养液上清中,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定显示其分子量为36kD左右,在诱导72小时后AtRACK1/OsRACK1蛋白表达量最大,该结果为进一步纯化RACK1蛋白,获得植物RACK1蛋白抗体奠定了基础.     

利用毕赤酵母表达植物甜蛋白（brazzein）的初步研究

实验将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德比赤酵母（Pichia pastori）GS115中，并从22个阳性克隆中筛选出His^＋Mut^s高拷贝转化子2个，经诱导表达，产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，目标蛋白的相对分子量与理论值一致，又经小试（5～10L罐）蛋白产量可达385mg/L。利用大孔树脂D152初步分离，得到有微甜味的产物。进一步纯化后获得了¹D-NMR图谱。     

重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制

在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时,遇到了较为严重的蛋白降解;为了抑制蛋白的降解,分别研究了温度、pH值和氮源的加入对降解的影响。结果表明,pH值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响,而温度的变化对降解的影响不大。当控制pH为7.0,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为0.5%和1%时,白蛋白的降解得到了有效的控制,可得到质量分数为58%的完整白蛋白。     

重组人生长激素在毕赤酵母中的表达研究

通过单因素分析和正交实验法优化高密度发酵培养基和诱导条件,根据优化结果指导发酵罐发酵.得到改良BSM培养基的最佳配比为甘油30g/L、酵母粉14g/L、K2SO4 13g/L、MgSO4·7H2O 11g/L、CaSO4 0.3g/L、PTM1 4.4mL、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.5);得到摇瓶培养最佳诱导条件为种龄24h,诱导时间30h,甲醇浓度2%,pH6.3～6.9.瑞士Bioengineering公司L1523型发酵罐发酵结果显示,细胞光密度(OD600)达到294,rHGH表达量最高达到0.54g/L.     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

植酸酶基因在毕赤酵母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母转化载体 p PIC9K/phy A ,电击法转化毕赤酵母 GS1 1 5 ,获得植酸酶基因重组酵母菌 GS1 1 5 /phy A .其发酵酶活性比 As3 .3 2 4提高了 3 3倍 .GS1 1 5 /phy A 植酸酶作用 p H有两个峰值 ,分别为 2 .5和4.5 ,最适作用温度为 60℃ .与 As3 .3 2 4相比 ,重组毕赤酵母 GS1 1 5 /phy A 植酸酶的热稳定性有显著提高 .     

毕赤酵母表达的人源Cu/Zn SOD的制备及稳定性分析

探讨了毕赤酵母表达人源Cu/Zn SOD的规模制备方法及稳定性研究.实验结果表明,采用45%乙醇复沉淀的方法来沉淀目标蛋白,目标蛋白回收率达88.89%,纯化倍数达到2.03倍,续而采用大孔树脂HPD500吸附的方法,去除了84.90%的色素,纯化倍数达4.60倍,比活为2700U·mg-1.经过纯化之后,将重组蛋白保存在4℃及低浓度、pH为7.8磷酸盐缓冲液条件37d,仍具有76.74%的活性.     

采用反向PCR技术优化适合毕赤酵母表达的截短型HPV58型L1基因

目的:探讨利用反向聚合酶链反应(反向PCR)技术根据毕赤酵母偏爱密码子优化截短型人乳头瘤病毒58型(HPV58)L1基因的研究.方法:设计PCR引物扩增截短型HPV58L1目的基因,将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC;测序并对目的基因进行序列分析;根据毕赤酵母偏爱密码子利用反向PCR技术设计引物对目的基因进行扩增.结果:扩增了截短型HPV58L1基因并将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC中;根据毕赤酵母偏爱密码子优化了截短型HPV58L1基因.结论:成功构建经密码子优化截短型HPV58L1基因的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC-HPV58L1.